[發明專利]一種8a型禽腺病毒毒株、滅活疫苗及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202111208145.7
• 申請日: 2021-10-18
• 公開（公告）號: CN113755454B
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 夏夢圓;羅意;羅峻;何怡;許俊才
• 申請（專利權）人: 貴州福斯特生物科技有限公司;貴州福牧生物技術研究有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;A61K39/235;A61P1/16;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 武漢知律知識產權代理事務所(普通合伙) 42307
• 代理人: 張成

1.一種8a型禽腺病毒毒株，其特征在于，所述毒株命名為DK02株，保藏編號為CCTCCNO:V202170，其中，所述病毒毒株為禽Ⅰ群腺病毒中的E種，血清型為8a型。

2.根據權利要求1所述的毒株制備得到的生物制品疫苗，其特征在于，所述疫苗含懸浮雞肝癌細胞培養的禽I群腺病毒DK02株滅活抗原，含量為滅活前≥10^8.5TCID₅₀/0.1ml。

3.根據權利要求1所述毒株的制備方法，其特征在于，所述毒株是通過蝕斑克隆純化得到，具體制備方法包括以下步驟：

（1）選取鋪滿單層的LMH貼壁細胞，棄掉原培養液，加入含有1％禽腺病毒DK02株病毒液的細胞維持液，置于37℃，5％CO₂培養，當細胞病變達80％以上時，凍融2次，收獲病毒液，即為F1代病毒，將F1代病毒在LMH貼壁細胞上傳代至F5，進行馴化培養；

（2）將F5代禽腺病毒DK02株病毒液用DMEM進行稀釋后接種至生長成致密單層的LMH細胞，吸附1h后，棄掉液體，加鋪第一層營養瓊脂，所述第一層營養瓊脂含有終濃度為1％低熔點瓊脂糖和含2％胎牛血清的DMEM，置CO₂培養箱，37℃，5％CO₂條件下倒置培養48h后，待細胞出現病變時加鋪第二層營養瓊脂，所述第二層營養瓊脂含有終濃度為1％低熔點瓊脂糖和含2％胎牛血清的1×DMEM，37℃，5％CO₂條件下避光倒置培養；

（3）待蝕斑形成后用滴頭吸出，連同瓊脂糖一起放入1.0ml的不含血清DMEM中，反復凍融3次，使病毒充分釋放，接種新的空白LMH細胞，進行病毒增殖，如此重復克隆三次，隨機挑選第四代克隆的五個蝕斑，即F9代病毒進行培養，測定病毒含量，分別挑選病毒含量最高的一株毒，通過LMH細胞繼續傳代，即可獲得純化后的禽I群腺病毒DK02株病毒液。

4.根據權利要求1所述毒株的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）貼壁LMH細胞制備及病毒接種、收獲：選取長勢良好的LMH貼壁細胞，棄掉原培養液，加入含有1％禽腺病毒DK02株病毒液的細胞維持液，置于37℃，5％CO₂培養，當細胞病變達80％以上時，凍融2次，收獲病毒液，即為適應于貼壁LMH細胞培養的DK02株病毒液；

（2）懸浮LMH細胞制備及病毒接種、收獲：將由貼壁LMH細胞擴繁得到的禽腺病毒DK02株基礎種毒用DMEM進行適當稀釋后接種至懸浮LMH細胞中，于37℃，120rpm振搖培養72~96?h后，凍融2次，收獲病毒液，分裝注明毒種代次及收獲時間。

5.根據權利要求1所述的毒株在制備預防由禽I群8a型腺病毒引起包涵體肝炎的獸用疫苗上的應用。

6.一種I群E種8a型禽腺病毒的滅活疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原來自權利要求1所述禽腺病毒DK02株。

7.根據權利要求6所述的滅活疫苗，其特征在于，所述滅活疫苗的制備方法包括如下步驟：

油相制備：

取礦物油95份，硬脂酸鋁1份，在油相制備管中混合均勻并加熱至75～85℃后，再加5份司本80，至溫度達到110～120℃時維持20～40分鐘，冷卻后完成油相制備；

水相制備：

將所述DK02株接種懸浮LMH細胞，培養72～96?h，收獲培養物為病毒液；取滅活的禽腺病毒血清8a型病毒抗原液95份，滅菌的5份吐溫80，充分混勻；

乳化：

取2份油相，1份水相，放入乳化罐中攪拌，即得所述滅活疫苗。