[發(fā)明專利]重組蛋白結(jié)構(gòu)域及其編碼DNA、增強(qiáng)TET酶及全基因組DNA甲基化檢測方法

有效

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• 申請日: 2021-10-18
• 公開（公告）號: CN113637053B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯策;韋磊;江翱;陳晶晶;黃開喻;滕以剛;曹振;宋東亮
• 申請（專利權(quán)）人: 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/11;C12Q1/6886;C07K19/00;C12N9/10
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

本發(fā)明提供了增強(qiáng)TET酶活性的重組蛋白結(jié)構(gòu)域，為DNA甲基化結(jié)合結(jié)構(gòu)域（MBD），MBD1?4的氨基酸序列如SEQ ID 1?4所示。通過MBD與TET酶融合形成的重組蛋白MBD?TET可以顯著增強(qiáng)TET酶包括NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD和hTET2CDT對5mC的氧化活性。此外，本發(fā)明還提供了簡便快速的高通量DNA甲基化檢測流程，提高基于TET酶氧化反應(yīng)的DNA甲基化檢測技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明專利涉及重組蛋白結(jié)構(gòu)域及其編碼DNA、增強(qiáng)TET酶及全基因組DNA甲基化檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

DNA胞嘧啶甲基化（5mC）是DNA中最常見的堿基修飾方式，約占所有胞嘧啶的1%-8%，被稱為“第五種堿基”。DNA甲基化與染色質(zhì)狀態(tài)和基因轉(zhuǎn)錄活躍程度具有明顯的相關(guān)性，是預(yù)測基因表達(dá)水平的有效依據(jù)。因此，DNA甲基化水平檢測是臨床疾病診斷的有效手段。現(xiàn)有的DNA甲基化檢測技術(shù)主要是依賴于反向篩選的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法，其原理是利用重亞硫酸鹽將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，再通過PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶。這種方法具有DNA損傷大、背景噪音高和準(zhǔn)確性低等缺陷。近年來，酶轉(zhuǎn)化法甲基化檢測技術(shù)因?yàn)榫邆銬NA損傷小、背景噪音低、準(zhǔn)確性高和數(shù)據(jù)質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)而成為DNA甲基化檢測領(lǐng)域的重要關(guān)注點(diǎn)。

DNA羥甲基化酶TET是真核生物中普遍存在的一種α-酮戊二酸（α-KG）和Fe2+依賴的雙加氧酶，在生物進(jìn)化過程中具有高度的保守性。TET酶是DNA去甲基化過程的關(guān)鍵蛋白，可以將5mC通過三步氧化反應(yīng)（5mC-5hmC-5fC-5caC）轉(zhuǎn)變成5caC。目前的酶轉(zhuǎn)化法DNA胞嘧啶甲基化檢測技術(shù)都是依賴于TET酶催化甲基化胞嘧啶的能力，TET蛋白是酶轉(zhuǎn)化法DNA甲基化檢測技術(shù)的核心蛋白，具有極大的工程改造和應(yīng)用價值。獲得一種高活性的重組TET酶突變體，對于體外DNA甲基化技術(shù)的發(fā)展和在疾病診斷領(lǐng)域的應(yīng)用，具有重要的價值。

本發(fā)明提供了增強(qiáng)TET酶活性的重組蛋白結(jié)構(gòu)域，為DNA甲基化結(jié)合結(jié)構(gòu)域（MBD），MBD1-4的氨基酸序列如SEQ ID 1-4所示。通過MBD與TET酶融合形成的重組蛋白MBD-TET可以顯著增強(qiáng)TET酶包括NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD和hTET2CDT的氧化活性。此外，本發(fā)明還提供了適用于MBD-TET的反應(yīng)緩沖液和簡便快速的高通量DNA甲基化檢測流程，能夠有效增強(qiáng)MBD-TET對5mC的氧化活性，提高基于TET酶氧化反應(yīng)的DNA甲基化檢測技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是提供一種可增強(qiáng)TET酶活性的重組蛋白結(jié)構(gòu)域。

所述的重組蛋白結(jié)構(gòu)域是DNA甲基化結(jié)合結(jié)構(gòu)域（MBD），MBD1-4氨基酸序列如SEQID 1-4所示，其中MBD1效果最優(yōu)。

以及上述MBD的編碼DNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.10-13中任一項(xiàng)所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種增強(qiáng)TET酶，為在NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD或hTET2CDT的氨基端通過GGGS連接肽連接上述的重組蛋白結(jié)構(gòu)域MBD1、MBD2、MBD3或MBD4，NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD、的hTET2CDT氨基酸序列分別如SEQ ID 5-9所示，其中NgTET1最優(yōu)。

本發(fā)明的又一目的是提供一種全基因組DNA甲基化檢測方法，其特征在于其步驟包括：

（1）采用上述的增強(qiáng)TET酶對模板DNA進(jìn)行氧化；

（2）還原劑處理，堿中和；

（3）DNA回收；

（4）DNA文庫構(gòu)建。

優(yōu)選的，步驟（1）中所述的氧化反應(yīng)時加入TET酶反應(yīng)緩沖液，該TET酶反應(yīng)緩沖液可以提高TET酶氧化5mC反應(yīng)中5caC產(chǎn)物的占比。