[發(fā)明專利]一種高效促進細胞外泌體分泌技術應用于骨修復材料制備

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111207008.1
• 申請日: 2021-10-15
• 公開（公告）號: CN115976102A
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設計）人: 孫晗笑;利時雨;耿承旭
• 申請（專利權）人: 艾威亞（廣州）醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N15/55;C12N5/077;A61K35/32;A61P19/08
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本發(fā)明通過脂質體介導Rab27a?pcDNA3.1?3xFlag?C重組質粒轉染hFOB1.19細胞，構建了hFOB1.19?Rab27a細胞，轉染后細胞穩(wěn)定表達Rab27a基因與蛋白，能夠分泌促成骨分化作用的外泌體。差速離心法提取的樣品Western?Blot、TEM、NTA結果符合外泌體特征。BCA、NTA檢測證明，hFOB1.19?Rab27a細胞單位時間內分泌外泌體的產量和效率顯著提高。本發(fā)明為一種高效促進細胞分泌促成骨分化作用的外泌體的技術策略。

技術領域

本發(fā)明屬構建hFOB1.19-Rab27a細胞進行的基礎研究領域,更具體地說，本發(fā)明涉及脂質體介導Rab27a-pcDNA3.1-3xFlag-C重組質粒轉染hFOB1.19細胞,能夠分泌具有促成骨分化作用的外泌體。

背景技術

外泌體為細胞分泌的微小囊泡，其中含有蛋白、核酸、脂質成分，外泌體具有介導細胞間通訊的作用。近年來，通過外泌體作為藥物遞送體系，或使用間充質干細胞外泌體進行組織缺損修復治療受到廣泛的關注。間充質干細胞在特定誘導分化條件下進行培養(yǎng)，其分泌的外泌體同樣具有促進細胞定向分化的功能，有研究對于成骨前體細胞?hFOB1.19、干細胞BMSCs進行成骨誘導培養(yǎng)并分別提取其外泌體，該外泌體對細胞成骨分化有促進作用。在骨組織工程中，雖然BMSCs作為常用的種子細胞，但是細胞系hFOB1.19較原代提取的BMSCs性質更加標準、穩(wěn)定，減少了因為供體差異引起的細胞品質差異，適合用于外泌體的標準化提取方案及成分分析研究。

在外泌體的發(fā)生和分泌過程中，Rab27a基因調控在外泌體分泌過時MVB與質膜的錨定對接，促進MVB與質膜融合釋放外泌體，研究顯示敲低Rab27a基因明顯降低了外泌體的分泌水平，造成胞內Alix標記的MVB積聚，但Rab27a表達水平的變化不會引起外泌體成分的改變。

發(fā)明內容

本發(fā)明通過脂質體介導Rab27a-pcDNA3.1-3xFlag-C重組質粒轉染?hFOB1.19細胞，構建了hFOB1.19-Rab27a細胞。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1Rab27a?pcDNA3.1-3xFlag-C質粒構建示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例1重組質粒Rab27a-pcDNA3.1-3xFlag-C的雙酶?切鑒定。

圖3為本發(fā)明實施例1RT-PCR檢測Rab27a的mRNA水平。

圖4為本發(fā)明實施例1WesternBlot檢測Rab27a的蛋白表達水平。

圖5為本發(fā)明實施例1BCA檢測外泌體蛋白濃度。

圖6為本發(fā)明實施例1WesternBlot檢測外泌體表面標志物。

圖7為本發(fā)明實施例1透射電鏡觀察外泌體形貌。

圖8為本發(fā)明實施例1hFOB1.19細胞內化外泌體。

具體實施方式

以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。

實施例1：Rab27a轉染hFOB1.19細胞的構建及外泌體分泌檢測材料與方法細胞和試劑：質粒Rab27a-pcDNA3.1-3xFlag-C(圖1)購于武漢金開瑞生物工程有限公司，大腸桿菌DH5α菌種為實驗室保藏菌株，小鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)實驗提取，人成骨細胞系(hFOB1.19-Rab27a)實驗構建，BCA蛋白濃度試劑盒，?Lipofectamine2000脂質體轉染試劑盒等購自Invitrogen。

實驗儀器：ABI熒光定量PCR和Nanosight納米粒徑儀購自美國ABI。