[發明專利]一種基于CRISPR技術檢測甘薯褪綠斑病毒的方法

在審

• 申請號: 202111199909.0
• 申請日: 2021-10-14
• 公開（公告）號: CN113832154A
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發明（設計）人: 王麗梅;趙瑩
• 申請（專利權）人: 舜豐生物科技（海南）有限公司;山東舜豐生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12Q1/70;C12Q1/6816
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 王正君;徐迅

本發明提供了一種基于CRISPR技術檢測甘薯褪綠斑病毒的方法，具體地，提供了基于CRISPR技術檢測甘薯褪綠斑病毒或甘薯病害的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和單鏈核酸檢測器進行檢測的步驟；本發明通過對gRNA的篩選和優化，提高了檢測效率，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及核酸檢測領域，涉及一種基于CRISPR技術檢測甘薯褪綠斑病毒的方法，尤其涉及基于CRISPR技術檢測甘薯褪綠斑病毒的方法、系統和試劑盒。

背景技術

甘薯褪綠斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus，SPCFV)，屬于線性病毒科(Flexiviridae)香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)病毒，是侵染甘薯的主要病害之一，雖然甘薯褪綠斑病毒單獨侵染甘薯時癥狀輕微，但是該病毒與甘薯褪綠矮化病毒共侵染甘薯時可形成協生病害，導致甘薯產生嚴重的癥狀。

甘薯褪綠斑病毒的檢測方法主要有：酶聯免疫吸附法、RT-PCR法。

本發明提供了一種新型的檢測甘薯褪綠斑病毒的方法，該方法是基于CRISPR技術，尤其是基于V型Cas酶的trans活性，提供的一種特異性高、檢測靈敏度高的快速檢測方法。

發明內容

本發明提供了一種基于CRISPR技術進行甘薯褪綠斑病毒檢測的方法、系統和試劑盒。

一方面，本發明提供了一種用于檢測甘薯褪綠斑病毒的gRNA，所述gRNA包括與Cas蛋白結合的區域和與靶核酸雜交的導向序列，所述靶核酸為來源于甘薯褪綠斑病毒的核酸。

本發明中，所述與CRISPR/CAS效應蛋白結合的區域又稱為同向重復序列、骨架區或spacer序列，該區域與Cas蛋白相互作用，從而結合Cas蛋白。

在一個實施方式中，所述gRNA自5’端至3’端依次包括與Cas蛋白結合的區域和與靶核酸雜交的導向序列。

在一個實施方式中，所述與靶核酸雜交的導向序列含有17-30個堿基，并且與SEQID No.1所示的序列或其反向互補序列雜交，并且所述導向序列包含SEQ ID No.3-5任一所示的序列；優選的，所述導向序列包含SEQ ID No.3、4、5任一所示的序列。

在優選的實施方式中，所述與靶核酸雜交的導向序列含有17-30個堿基，例如，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個堿基。

在一個實施方式中，所述與靶核酸雜交的導向序列包含SEQ ID No.3-5任一所示的序列，并且在SEQ ID No.3-5任一所示的序列的3’端還包括1-13個堿基(優選，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個堿基)，并且，所述與靶核酸雜交的導向序列與SEQ ID No.1所示的序列或其反向互補序列雜交；優選的，所述導向序列包含SEQ ID No.3、4、5任一所示的序列。

在一個實施方式中，所述與靶核酸雜交的導向序列與SEQ ID No.3-5任一所示的序列相比，在SEQ ID No.3-5任一所示的序列的3’端連續缺失1-5個堿基(例如，1、2、3、4、5個堿基)。

所述與SEQ ID No.1所示的序列或其反向互補序列雜交，是指上述導向序列與SEQID No.1或SEQ ID No.1的反向互補序列的連續的一段可以連續的互補配對。比如，所述與靶核酸雜交的導向序列含有30個堿基，則，導向序列的30個堿基需要與SEQ ID No.1或SEQID No.1的互補序列的連續30個堿基互補配對。

在更優選的實施方式中，所述與靶核酸雜交的導向序列如SEQ ID No.3-5任一所示。

在一個實施方式中，所述Cas蛋白選自V型Cas蛋白，例如，Cas12、Cas14家族蛋白或其突變體。