[發(fā)明專利]一種利用海水微擬球藻生產(chǎn)蜂王漿主效成分24-亞甲基膽固醇的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111192566.5
• 申請(qǐng)日: 2021-10-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114058515B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 路延篤;鄧湘子;周文序;甘琴華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 海南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/13
• 分類號(hào): C12N1/13;C12N15/82;C12N15/55;C12N15/31;C12P33/00;A23L33/10;A23K10/16;A23K50/80;C12R1/89
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 任美玲

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種微擬球藻工程株及其制備方法和應(yīng)用。該工程株為敲除DWARF1(DWF1)基因的微擬球藻。本發(fā)明利用CRISPR?CAS9技術(shù)，在不引入任何外源分子標(biāo)簽的前體下，構(gòu)建出DWF1基因的敲除株，得到膽固醇含量顯著降低、24?亞甲基膽固醇含量顯著提高的工程株，其遺傳性狀穩(wěn)定。4?亞甲基膽固醇是蜂王漿主成分，具降血壓、抗心律失常、血管解痙等活性。若將此工程株產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，有助于填補(bǔ)高24?亞甲基膽固醇微藻這一領(lǐng)域的空白，實(shí)現(xiàn)利用海洋微擬球藻開(kāi)發(fā)高24?亞甲基膽固醇、高二十碳五烯酸、低膽固醇的健康食品，并為利用海水和二氧化碳工業(yè)化生產(chǎn)人造蜂王漿提供理論依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種微擬球藻工程株及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

微擬球藻(Nannocloropsis?oceanica)是一種光合自養(yǎng)的圓球狀的單細(xì)胞生物，在缺氮脅迫條件下能產(chǎn)生大量的脂質(zhì)積累，累積量高達(dá)其生物量干重的60％，故常用作生物柴油的潛在替代品。除此之外，它也能用作一系列高附加值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，如食品、飼料添加劑、色素、化妝品、藥品等。而其代謝產(chǎn)物如葉綠素、甾醇、類胡蘿卜素和一些植物激素，決定了對(duì)生長(zhǎng)或產(chǎn)生有價(jià)值的化學(xué)物質(zhì)至關(guān)重要的細(xì)胞特性。微擬球藻富含油脂，且有特別高含量的PUFA(polyunsaturated?fatty?acid，多不飽和脂肪酸)，如EPA(eicosapentaenoic?acid，二十碳五烯酸)，它在功能食品、功能餌料等方面具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及廣闊的應(yīng)用前景。

膽固醇是構(gòu)成人體組織細(xì)胞所不可或缺的重要組成物質(zhì)，它不僅參與細(xì)胞膜的形成，而且是合成維生素D、膽汁酸及甾體激素的重要原料。但當(dāng)人體血清膽固醇含量過(guò)高時(shí)，易導(dǎo)致高膽固醇血癥的發(fā)生，對(duì)人體產(chǎn)生不利的影響。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化性、心腦血管疾病及冠心病等的發(fā)生與高膽固醇血癥有密切的聯(lián)系。因此，降低血清中過(guò)多的膽固醇含量對(duì)人身體健康是有利的。微擬球藻因其富含EPA，被廣泛用于功能食品和功能餌料開(kāi)發(fā)，但卻因含有高的膽固醇而飽受詬病。

微擬球藻中膽固醇的合成前體是24-亞甲基膽固醇(Lu?et?al.,2014?Regulationof?the?cholesterol?biosynthetic?pathway?and?its?integration?with?fattyacidbiosynthesis?inthe?oleaginous?microalgaNannochloropsis?oceanica)。24-亞甲基膽固醇是蜂王漿主要的甾體化合物，具有降血壓、降低血清膽固醇、減慢心率、抗心律失常、血管解痙等多種生物活性(Chakrabarti?et?al.,2020?Evaluating?effects?of?acritical?micronutrient(24-methylenecholesterol)on?honey?bee?physiology)。

目前，還未見(jiàn)針對(duì)膽固醇和24-亞甲基膽固醇含量進(jìn)行改造的微擬球藻工程株。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種微擬球藻工程株及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明獲得一株低膽固醇、高24-亞甲基膽固醇工程微擬球藻細(xì)胞，其膽固醇含量下降98.7％，24-亞甲基膽固醇含量提高了222倍，且性狀可穩(wěn)定遺傳，可用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)高多不飽和脂肪酸、高24-亞甲基膽固醇、低膽固醇的功能食品和水產(chǎn)餌料，為綠色健康產(chǎn)業(yè)服務(wù)。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種微擬球藻工程株，其為敲除DWF1基因的微擬球藻。

本發(fā)明還提供了該微擬球藻工程株的制備方法，采用CRISPR/Cas9技術(shù)將微擬球藻中的DWF1基因敲除。

本發(fā)明還提供了該微擬球藻工程株的培養(yǎng)方法，將微擬球藻工程株接種于平板培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；平板培養(yǎng)基配方為：

優(yōu)選地，平板培養(yǎng)基配方為：