[發明專利]一種植物基因表達載體的構建方法和應用

在審

• 申請號: 202111188664.1
• 申請日: 2021-10-12
• 公開（公告）號: CN113980995A
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發明（設計）人: 李欣勇;陳志堅;董榮書;劉攀道;黃睿;丁西朋
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 張國棟

1.一種植物基因表達載體的構建方法，其特征在于，所述植物基因表達載體的構建方法包括以下步驟：

步驟一，從植物基因組中分離靶標基因對應的基因序列：根據靶標基因設計聚合酶鏈式反應引物，進行聚合酶鏈式反應即PCR；將DNA模板、設計的引物、聚合酶、dNTP、緩沖液以及MgCl₂混合均勻，構成PCR體系；進行預變性和20～30次擴增溫度循環，循環結束后，于72℃的條件下補齊并延伸處理10～15min后反應結束；反應結束后，進行靶標基因擴增處理，即可得到靶標基因對應的基因序列，測序備用；

步驟二，構建質粒載體：在質粒的啟動子和終止子之間引入多克隆酶切位點；利用限制性內切酶，對質粒進行雙酶切處理；將雙酶切后的質粒，經1％的瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取目的條帶，通過凝膠回收方法或凝膠回收試劑盒獲得經過切除處理的的質粒；基于引入的酶切位點、限制性內切酶合成DNA片段，將所述DNA片段與已進行切除處理的質粒進行連接；連接后的重組質粒利用熱激法轉化到大腸桿菌的感受態細胞中；將轉化后的大腸桿菌平涂于含有卡那霉素的LB固體培養基上培養，挑取單獨菌落進行菌落PCR鑒定，篩選含有重組質粒的陽性菌落；將陽性菌落經卡那霉素的LB液體培養基擴繁后，利用質粒提取方法提取重組質粒DNA，即可得到質粒載體，備用；

步驟三，將含有靶標基因對象基因序列連接到構建的質粒載體上，構建含靶標基因的植物表達載體：對步驟一構建得到的質粒載體進行雙酶切處理，并將酶切產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳后分別回收目的基因片段以及酶切載體；將回收的質粒載體與含有靶標基因對象基因序列進行連接，挑取培養平板上生長良好的單菌落，置于含有卡那霉素的LB液體培養基中振蕩培養一段時間；取培養后的菌液進行PCR擴增，將PCR檢測呈陽性的菌落克隆在20～30mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中進行擴大培養；提取質粒，進行雙酶切鑒定，利用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測含有目的片段大小的條帶，即可得到構建好的植物基因表達載體。

2.如權利要求1所述的植物基因表達載體的構建方法，其特征在于，步驟一中，所述緩沖液為T4 DNA連接酶緩沖液，由500mM Tris-HCl，8％的1,3-丙二醇，2.0mM DTT，5～20mMATP組成，pH 8.0。

3.如權利要求1所述的植物基因表達載體的構建方法，其特征在于，步驟一中，所述循環的條件為：90℃預變性8～12min，85℃變性60sec，45℃退火25sec，65℃延伸20sec，循環20～30次。

4.如權利要求1所述的植物基因表達載體的構建方法，其特征在于，步驟二中，利用T4-DNA連接酶或質粒連接用試劑盒將所述DNA片段與已進行切除處理的質粒進行連接。

5.如權利要求1所述的植物基因表達載體的構建方法，其特征在于，步驟二中，所述卡那霉素濃度為50mg/L。

6.如權利要求1所述的植物基因表達載體的構建方法，其特征在于，步驟二中，所述質粒提取方法包括：

(1)將含有目的質粒的大腸桿菌接種培養，得到大腸桿菌培養菌液，進行離心，去除上清液，得到大腸桿菌體沉淀；將大腸桿菌體沉淀加入菌體裂解試劑進行菌體裂解，得到呈半透明狀裂解液，室溫靜置2～3min；

(2)向呈半透明狀裂解液中加入雜質去除試劑，充分混合后，高速離心，取上清菌液，備用；

(3)將上清菌液上樣層析柱，進行洗脫，收集含有質粒的洗脫液，重復洗脫四次，即可得提取的質粒。

7.如權利要求6所述的植物基因表達載體的構建方法，其特征在于，所述向呈半透明狀裂解液中加入雜質去除試劑包括：按每1mL大腸桿菌培養菌液加入40～60μL雜質去除試劑的比例添加所述雜質去除試劑；其中，所述雜質去除試劑為乙酸﹑氯化鈉的混合液。

8.如權利要求6所述的植物基因表達載體的構建方法，其特征在于，所述高速離心的條件為：設置高速離心機的離心速率為3000～4500轉/分鐘，離心分離時間為10～15min。