[發明專利]孔蛋白單體的突變體、蛋白孔及其應用

在審

• 申請號: 202111186255.8
• 申請日: 2021-10-12
• 公開（公告）號: CN113754743A
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 劉少偉;岳飛飛;謝馥勵;趙帥
• 申請（專利權）人: 成都齊碳科技有限公司
• 主分類號: C07K14/28
• 分類號: C07K14/28;C12N15/31;C07K19/00;G01N27/447;G01N33/487;C12Q1/6869
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 郭翠霞;楊青

本發明屬于靶分析物特性的表征技術領域，具體提供了一種孔蛋白單體的突變體、包含其的蛋白孔、以及其檢測靶分析物的應用，其中所述孔蛋白單體的突變體的氨基酸包括SEQ ID NO:1所示的序列或與其具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％或50％同一性的序列，并且所述孔蛋白單體的突變體的氨基酸包括在對應SEQ ID NO:1的Q68、N72、和F73的一個或多個位置處的突變。

技術領域

本發明屬于靶分析物特性的表征技術領域，特別涉及一種孔蛋白單體的突變體、包含其的蛋白孔以及其檢測靶分析物的應用。

背景技術

隨著對核酸結構和序列的研究，核酸測序技術不斷發展，成為生命科學研究的核心領域，對生物、化學、電學、生命科學、醫學等領域的技術發展起到巨大的推動作用。利用納米孔研究出新型的快速、準確、低成本、高精度及高通量的核酸測序技術是后人類基因組計劃的熱點之一。

納米孔(Nanopore)測序技術，又被稱為第四代測序技術，是一種以單鏈核酸分子作為測序單元，利用一個能夠提供離子電流通道的納米孔，使得單鏈核酸分子在電泳驅動下通過該納米孔，當核酸通過納米孔時，會減少納米孔的電流，對產生的不同信號實時讀取序列信息的基因測序技術。

納米孔測序主要特點是：讀長很長，準確率較高，錯誤區大都發生在均聚寡核苷酸區域。納米孔測序不但可實現天然DNA和RNA測序還可直接獲取DNA和RNA的堿基修飾信息，例如它能夠直接讀取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代測序方法那樣需要事先對基因組進行重亞硫酸鹽(bisulfite)處理，這對于在基因組水平直接研究表觀遺傳相關現象有極大推動。納米孔檢測技術作為一個新型平臺，具有低成本、高通量、非標記等優勢。

納米孔分析技術起源于Coulter計數器的發明以及單通道電流的記錄技術。生理與醫學諾貝爾獎獲得者Neher和Sakamann在1976年利用膜片鉗技術測量膜電勢，研究膜蛋白及離子通道，推動了納米孔測序技術的實際應用進程。1996年，Kasianowicz等提出了利用α-溶血素對DNA測序的新設想，是生物納米孔單分子測序的里程碑標志。隨后，MspA孔蛋白、噬菌體Phi29連接器等生物納米孔的研究報道，豐富了納米孔分析技術的研究。Li等在2001年開啟了固態納米孔研究的新時代。受限于半導體和材料工業的發展，固態納米孔測序進展緩慢。

納米孔測序技術的關鍵點之一在于所設計的一種特殊生物納米孔，孔內縊縮區形成的讀取頭結構可在當單鏈核酸(例如ssDNA)分子通過納米孔時，造成孔道電流的阻塞，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度(每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的)，最后高靈敏度的電子設備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基。目前采用蛋白孔作為納米孔進行測序，孔蛋白主要以大腸桿菌為來源。

目前納米孔蛋白單一，需要開發替代的納米孔蛋白實現納米孔測序技術。孔蛋白也與測序精度密切相關，而且孔蛋白還涉及與控速蛋白的相互作用的模式變化，進一步優化孔蛋白與控速蛋白相互作用界面的穩定性，對提高測序數據的一致性和穩定性有積極影響。納米孔測序技術的準確率也有待改善，因此，需要開發改進的納米孔蛋白，以進一步提高納米孔測序的分辨率。

發明內容

為解決上述問題，本發明實施例的目的在于提供一種替代的孔蛋白單體的突變體、包含其的蛋白孔、及其應用。

第一方面，本發明實施例提供了一種孔蛋白單體的突變體，其中所述孔蛋白單體的突變體的氨基酸包括SEQ ID NO:1所示的序列或與其具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％或50％同一性的序列，或由其組成，并且所述孔蛋白單體的突變體的氨基酸包括在對應SEQ ID NO:1的Q68、N72、和F73中的一個或多個位置處的突變；

Q68、N72、和F73中的一個或多個具體為：(1)Q68；(2)N72；(3)F73；(4)Q68和N72；(5)Q68和F73；(6)N72和F73；(7)Q68、N72和F73。