[發明專利]一種具有促進毛發再生功能的基因重組MSC及其外泌體樣納米材料的制備方法和應用

有效

• 申請號: 202111175436.0
• 申請日: 2021-10-09
• 公開（公告）號: CN113897387B
• 公開（公告）日: 2023-09-05
• 發明（設計）人: 張明杰;馬云坤
• 申請（專利權）人: 深圳市漢科生命工程有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/0775;C12N5/10;C12N15/113;A61K35/28;A61P17/14
• 代理公司: 深圳市鼎智專利代理事務所(普通合伙) 44411
• 代理人: 黃曉玲

1.具有促進毛發再生功能的基因重組MSC外泌體樣納米材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S101：制備臍帶間充質干細胞hU-MSC；

S102：構建Jag1膜表面展示質粒pD-Jag1；

S103：構建miR-218-5p?miRNA過表達質粒；

S104：在細胞膜表面表達Jagged?1蛋白質及細胞內表達miR-218-5p?miRNA的基因重組MSC?JagmirMSC細胞；

S105：把JagmirMSC細胞進一步加工成為外泌體樣納米材料。

2.根據權利要求1所述的具有促進毛發再生功能的基因重組MSC外泌體樣納米材料的制備方法，其特征在于，在所述的S101中，包括：

S1011：無菌條件下采集臍帶，把臍帶剪成小段，每段1cm，抽去動靜脈，在玻璃瓶中剪碎，裝在15ml離心管中，加膠原酶，消化3h后用100目過濾網過濾或500rpm離心3-5分鐘，棄去未消化組織塊，將上清液移至15ml離心管，每管5ml，加PBS至10ml，高速離心，棄去上清，取沉淀移至培養皿中培養，置37℃，5%CO₂飽和濕度孵箱內孵育，48h半量換液，4d后全量換液，棄去大量的懸浮細胞；

S1012：以后根據培養基顏色每3-4d換液，待原代細胞達到覆蓋培養皿的60-80%后，進行1：2傳代；

S1013：hU-MSC的鑒定及使用標準：取第3-10代hU-MSC，當細胞數量達到10⁸時，用PBS沖洗2次后，滴加0.05%的Trypsin-EDTA液消化，后加培養基終止消化，制成（1-3）×10⁶的細胞懸液，用流式細胞儀進行檢測顯示：CD14或CD11b、CD79a或CD19、CD34、CD45、CD109、HLA-DR陰性2%；CD29、CD44、CD73、CD90、CD105陽性率均95%，EB病毒、巨細胞病毒、HIV病毒、乙肝病毒、支原體、細菌培養、真菌培養均陰性；

S1014：直接使用，或液氮保存備用。

3.根據權利要求1所述的具有促進毛發再生功能的基因重組MSC外泌體樣納米材料的制備方法，其特征在于，在所述的S102中，包括：

S1021：引物設計

1）引物1?Jag1upSfiI:?GACGTCGGCCGACGTGGCCatgcgttccccacggacgcgc；

2）引物2?Jag1dnSalI:?GACGTCGTCGACctatacgatgtactccattcg；

S1022：制備RNA：采志愿者外周血50ml，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞PBMC，再用TRIzol試劑制備總RNA；

S1023：RT-?PCR：

以總RNA為模版，引物1和引物2引物，用Invitrogen?SuperScript?IV一步法RT-PCR試劑盒制備Jag1基因片段，用EZ?spin柱式PCR產物純化試劑盒純化；

S1024：?限制性內切酶消化pDisplay載體及Jag1基因片段

分別用SfiI/SalI限制性內切酶消化pDisplay載體及Jag1基因片段，用EZ-10?SpinColumn?DNA?PAGE?Gel?Extraction?Kit分別純化，獲得pDisplay?SfiI/SalI及Jag1?SfiI/SalI?2個酶切產物；

S1025：連接

用DNA連接酶連接pDisplay?SfiI/SalI及Jag1?SfiI/SalI?片段，獲得pD-Jag1連接產物；

S1026：轉染感受態菌：

用pD-Jag1連接產物轉染DH5α感受態細菌；

S1027：?挑菌落及驗證：

挑陽性菌落，小量培養，提取質粒DNA，用SfiI/SalI限制性內切酶切進行初選，最后測序確認；

S1028：保存pD-Jag1重組菌；

S1029：大量培養pD-Jag1重組菌，制備pD-Jag1重組質粒。