[發(fā)明專利]檢測血液中多種類固醇激素的方法及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111171737.6
• 申請日: 2021-10-08
• 公開（公告）號: CN113720946A
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡俊;賈鵬飛
• 申請（專利權(quán)）人: 艾可泰科生物科技（江蘇）有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72
• 代理公司: 無錫風(fēng)創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32461
• 代理人: 駱莉

1.檢測血液中多種類固醇激素的方法，其特征在于，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測經(jīng)過前處理的血液中DHEA、DHT、P5、17OHP5；

S1、利用高效液相色譜將DHEA、DHT、P5、17OHP5與干擾物分離；

S2、利用同位素內(nèi)標(biāo)法定量；

S3、以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的濃度比為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為Y軸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣本中DHEA、DHT、P5、17OHP5的含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測血液中多種類固醇激素的方法，其特征在于，高效液相色譜的具體條件為：

流動相A：體積比為0.1％的甲酸水；

流動相B：乙腈，純度為色譜純；濃度為100％；

色譜柱型號：Waters XBridge BEH C18，3.5μm,2.1mm*150mm；

采用梯度洗脫方式，見表1；

流速為0.2ml/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣體積為10μl。

表1流動相梯度洗脫參數(shù)

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測血液中多種類固醇激素的方法，其特征在于，質(zhì)譜條件為：

在電噴霧電離正離子檢測模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜掃描模式；噴霧電壓為5500V；碰撞氣為8；氣簾氣為20psi；離子源溫度為650℃；離子源氣流GS1為70psi；GS2為50psi；目標(biāo)物DHEAm/z 332.2→253.1，d6-DHEAm/z 338.2→253.1；DHTm/z 334.2→105.1，d3-Tm/z 337.2→105.1；P5m/z 360.2→300.1，d2,¹³C2-P5m/z 364.2→304.1；17OHP5m/z358.2→145.1，d2,¹³C2-17OHP5m/z 362.2→145.1；

5種類固醇激素及內(nèi)標(biāo)的去簇電壓-DP、射入電壓-EP、碰撞電壓-CE、碰撞室射出電壓-CXP參數(shù)見表2。

表2睪酮及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測血液中多種類固醇激素的方法，其特征在于，所述經(jīng)前處理的血液按照如下方法制備得到：取血液300μl于2ml離心管中，加入混合內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋震蕩1min，13000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移所有清液至另一2ml離心管，氮?dú)獯蹈桑虼蹈呻x心管中加入水稍作渦旋，再向其中加入萃取液，渦旋振蕩萃取，轉(zhuǎn)移有機(jī)相至另一2ml離心管，重復(fù)上述操作再萃取一次，合并兩次有機(jī)相；氮?dú)獯蹈桑?/p>

向吹干后的離心管中加入衍生劑，密封避光水浴反應(yīng)；反應(yīng)完成后以13000r/min離心5min取上清，進(jìn)樣10μl上機(jī)檢測。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測血液中多種類固醇激素的方法，其特征在于，混合內(nèi)標(biāo)溶液配制：分別精確稱取1mg d6-DHEA、d3-DHT、d2,¹³C2-P5、d2,¹³C2-17OHP5標(biāo)準(zhǔn)品于4個10ml容量瓶，用乙腈溶解定容至刻度，得到100μg/ml d6-DHEA、d3-DHT、d2,¹³C2-P5、d2,¹³C2-17OHP5內(nèi)標(biāo)母液；

取10μl 100μg/ml d6-DHEA、d2,¹³C2-P5、d2,¹³C2-17OHP5和1μl 100μg/ml d3-DHT內(nèi)標(biāo)母液于10ml容量瓶，用乙腈稀釋定容至刻度得100ng/ml d6-DHEA、d2,¹³C2-P5、d2,¹³C2-17OHP5和10ng/ml d3-DHT混合溶液；

取0.25ml所述混合溶液用乙腈稀釋定容至100ml得到濃度為0.25ng/ml d6-DHEA、d2,¹³C2-P5、d2,¹³C2-17OHP5和0.025ng/ml d3-DHT實(shí)驗(yàn)用混合內(nèi)標(biāo)溶液。