[發明專利]一種以L-酪氨酸為底物生物合成白藜蘆醇的工程菌、構建及應用

在審

• 申請號: 202111170854.0
• 申請日: 2021-10-08
• 公開（公告）號: CN113930349A
• 公開（公告）日: 2022-01-14
• 發明（設計）人: 趙云現;姜黎;崔金旺;楊志彬;胡江林;田昊博;趙凱
• 申請（專利權）人: 河北維達康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/60;C12N15/54;C12N15/52;C12N15/66;C12P7/22;C12R1/645
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 喬宇

1.以L-酪氨酸為底物生物合成白藜蘆醇的工程菌的構建方法，具體包括以下步驟：

(1)利用酶切方法對質粒載體進行線性化處理，回收產物為線性化載體片段；

(2)利用特異性引物分別對L-酪氨酸氨解酶基因、對香豆酰基輔酶A連接酶基因和白藜蘆醇合成酶基因進行PCR擴增，回收得到目的片段；

(3)利用DNA連接酶將所述含有L-酪氨酸氨解酶、對香豆酰基輔酶A連接酶和白藜蘆醇合成酶編碼基因的目的片段與所述線性化載體進行連接、轉化，得到重組表達質粒載體-TAL、質粒載體-4CL、質粒載體-STS；

(4)利用前述重組表達質粒載體-TAL、質粒載體-4CL、質粒載體-STS構建重組質粒-TAL-4CL-STS；

(5)將重組質粒-TAL-4CL-STS經酶切，線性化后利用轉入解脂耶氏酵母Po1f中，培養挑取陽性轉化子，獲得能夠產生白藜蘆醇的初始工程菌。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：步驟(4)所述的構建重組質粒TAL-4CL-STS的具體步驟為：

分別使用特異性引物擴增hp4d-4CL-XPR2、hp4d-STS-XPR2表達框，并使用Overlap PCR連接，擴增得到hp4d-4CL-XPR2-hp4d-STS-XPR2雙重表達框，通過無縫克隆插入線性化質粒pINA1269-TAL，最終得到重組質粒TAL-4CL-STS；

或分別使用特異性引物擴增hp4d-4CL-XPR2、hp4d-TAL-XPR2表達框，并使用OverlapPCR連接，擴增得到hp4d-4CL-XPR2-hp4d-TAL-XPR2雙重表達框，通過無縫克隆插入線性化質粒pINA1269-STS，最終得到重組質粒pINA1269-TAL-4CL-STS；

或分別使用特異性引物擴增hp4d-TAL-XPR2、hp4d-STS-XPR2表達框，并使用OverlapPCR連接，擴增得到hp4d-TAL-XPR2-hp4d-STS-XPR2雙重表達框，通過無縫克隆插入線性化質粒pINA1269-4CL，最終得到重組質粒pINA1269-TAL-4CL-STS。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：還包括：

(6)以人工合成的ACC基因為模板，使用特異性引物進行擴增，酶切連接后構建得到重組質粒-ACC；

或以人工合成的ACC、ACS基因為模板，使用Overlap PCR擴增得到融合基因：ACC-ACS酶切連接后構建得到重組質粒-ACC-ACS；

(7)將重組質粒質粒-ACC或-ACC-ACS用限制性內切酶酶切，線性化后轉化入前述能夠產生白藜蘆醇的初始工程菌，培養挑取陽性轉化子，獲得能夠生成白藜蘆醇的工程菌株。

4.一種以L-酪氨酸為底物生物合成白藜蘆醇的工程菌，過表達L-酪氨酸氨解酶、對香豆酰基輔酶A連接酶和白藜蘆醇合成酶，同時過表達乙酰輔酶A羧化酶基因，或過表達乙酰輔酶A羧化酶基因和乙酰輔酶A合成酶基因。

5.根據權利要求4所述的工程菌，其特征在于：所述過表達L-酪氨酸氨解酶、對香豆酰基輔酶A連接酶和白藜蘆醇合成酶的方法是將所述L-酪氨酸氨解酶基因、對香豆酰基輔酶A連接酶基因和白藜蘆醇合成酶基因全部置于表達質粒的啟動子之后進行表達，所述L-酪氨酸氨解酶基因、白藜蘆醇合成酶基因序列和對香豆酰基輔酶A連接酶基因通過整合型質粒在解脂耶氏酵母中進行共表達，所述L-酪氨酸氨解酶基因、香豆酰基輔酶A連接酶和藜蘆醇合成酶在工程菌株中通過hp4d啟動子啟動轉錄。