[發明專利]一種豬偽狂犬病病毒基因缺失株、疫苗組合物及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202111166908.6
• 申請日: 2021-09-30
• 公開（公告）號: CN113862230B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 李玲;張艷賓;李鵬宇;劉新月;張欣;李靜;黃書林;張蕾;董春娜;張彤;肖進;齊鵬
• 申請（專利權）人: 中牧實業股份有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N7/04;C12N15/38;C12N15/54;C12N15/65;C12N15/85;C12N15/869;A61K39/245;A61P31/22
• 代理公司: 北京惟誠致遠知識產權代理事務所(普通合伙) 11536
• 代理人: 王慧鳳

1.一株豬偽狂犬病毒(pseudorabies?virus)變異強毒株，命名為PRV?GX-2017，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC?No.22110。

2.一株豬偽狂犬病病毒變異株PRV?GX-2017株的基因缺失毒株，其特征在于所述的毒株是在權利要求1所述的豬偽狂犬病病毒變異強毒株PRV?GX-2017的基礎上，通過基因工程方法，將PRV?GX-2017基因組中TK基因部分序列、gI基因的部分序列、US2基因的部分序列、gE基因的全部序列和US9基因的全部序列缺失，獲得所述的豬偽狂犬病病毒變異株PRV?GX-2017株的基因缺失毒株；缺失的基因序列為：PRV?GX-2017變異株基因組中TK基因的CDS區的第303位堿基至第908位堿基之間的DNA序列，以及gI基因CDS區的第268位堿基至US2基因CDS區的第284位堿基之間的DNA序列；

所述TK基因的序列如序列表中序列1所示；所述gI基因的序列如序列表中序列2所示；所述gE基因的序列如序列表中序列3所示；所述US9基因的序列如序列表中序列4所示；所述US2基因的序列如序列表中序列5所示。

3.權利要求2所述的豬偽狂犬病病毒變異株GX-2017株的基因缺失毒株的構建方法，其特征在于，該毒株的構建步驟為：

(1)gI-US2轉移質粒的構建，以pUC載體為骨架載體，構建轉移載體pUC-IES和pUC-IES-EGFP：在pUC載體中插入豬偽狂犬病病毒變異株PRV?GX-2017株基因組中gI基因缺失位點之前的部分序列作為左同源臂、US2基因缺失位點之后的部分序列作為右同源臂，得到轉移載體pUC-IES；左右同源臂間插入EGFP基因表達框，得到pUC-IES-EGFP；

(2)TK轉移質粒的構建，以pUC載體為骨架載體，構建轉移載體pUC-TK-EGFP：在pUC載體中插入豬偽狂犬病病毒變異株PRV?GX-2017株基因組中TK基因缺失5′位點之前的部分序列作為左同源臂、TK基因缺失3′位點之后的部分序列作為右同源臂，得到轉移載體pUC-TK；左右同源臂間插入EGFP基因表達框，得到pUC-TK-EGFP；

(3)缺失gI-US2基因病毒的構建：轉移載體pUC-IES-EGFP轉染經親本GX-2017病毒感染的Vero細胞，通過蝕斑篩選，獲得表達綠色熒光蛋白的缺失病毒PRV?GX-ΔIES-EGFP；然后轉移載體pUC-IES轉染經缺失病毒PRV?GX-ΔIES-EGFP感染的Vero細胞，通過蝕斑篩選，獲得GX-2017變異株缺失病毒PRV?GX-ΔIES；

(4)缺失TK基因病毒的構建，轉移載體pUC-TK-EGFP轉染經缺失病毒PRV?GX-ΔIES感染的Vero細胞，通過蝕斑篩選，獲得表達綠色熒光蛋白的缺失病毒PRV?GX-ΔTK/IES-EGFP，然后將轉移載體pUC-TK轉染經缺失病毒PRV?GX-ΔTK/IES-EGFP感染的Vero細胞，通過蝕斑篩選，獲得GX-2017變異株缺失病毒PRV?GX-ΔTK/IES；

所述步驟(1)中，所述左同源臂的序列為序列表中序列6，所述右同源臂的序列為序列表中序列7；所述步驟(2)中，所述左同源臂的序列為序列表中序列8，所述右同源臂的序列為序列表中序列9。

4.一種疫苗組合物，其特征在于，由權利要求2所述的豬偽狂犬病病毒變異株GX-2017株的基因缺失毒株和藥學上可接受的佐劑組成。

5.權利要求2所述的豬偽狂犬病病毒變異株GX-2017株的基因缺失毒株在制備預防豬偽狂犬病疫苗中的應用。