[發明專利]一種球形賴氨酸芽孢桿菌C3-41來源的氨肽酶Amp0279及其重組菌株和應用

在審

• 申請號: 202111166141.7
• 申請日: 2021-09-30
• 公開（公告）號: CN114015678A
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 熊海容;胡曉敏;趙普瑛;張萌
• 申請（專利權）人: 中南民族大學
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C12N15/57;C12N15/75;C12N15/70;C12N1/21;A23K10/14;A23L29/00;C12R1/125;C12R1/19
• 代理公司: 武漢華旭知識產權事務所 42214
• 代理人: 高劍鋒

本發明公開了一種球形賴氨酸芽孢桿菌C3?41來源的氨肽酶Amp0279的基因及氨基酸序列，構建了包含該酶編碼基因的重組質粒和重組大腸桿菌BL21(pET28a?amp0279)、重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisWB800N(pHT43?amp0279)。將該酶在大腸桿菌中異源表達，利用鎳柱親和層析的方法將其純化，并以Leu?pNA為底物檢測純化蛋白的酶學性質。本發明提供的氨肽酶Amp0279最適反應條件是50℃，pH為8.0，在40?55℃，pH6.0?9.0范圍內酶活力穩定，在加入100μMCo²⁺后，比酶活力可達35383U/mg，適用于飼料、食品、釀造和醫藥等工業領域。

技術領域

本發明屬于蛋白質工程和基因工程領域，具體涉及一種球形賴氨酸芽孢桿菌C3-41來源的氨肽酶Amp0279及其重組菌株和應用。

背景技術

在發酵、陳化等食品加工過程中，蛋白質會經蛋白酶、肽酶水解成多肽或氨基酸等小分子物質，或破壞致敏表位，降低致敏潛力，更利于人體攝入和吸收。蛋白質水解物因而在食品工業中應用廣泛。但蛋白質水解過程會產生苦味肽，影響食品的風味，阻礙蛋白質水解物的推廣。氨肽酶(EC 3.4.11.-)是一類對蛋白質水解產物有脫苦作用的酶，能夠特異性水解苦味肽氨基末端疏水氨基酸殘基，一次釋放一到三個氨基酸，破壞苦味肽結構，達到脫苦的效果。氨肽酶廣泛存在于真菌、動植物中，種類繁多，常常用其定位區域(比如細胞膜、胞漿)來命名亞型。氨肽酶也可像羧肽酶一樣按照活性中心分為絲氨酸氨肽酶、金屬氨肽酶和半胱氨酸氨肽酶。70％以上的氨肽酶為金屬酶，其活性中心含有一個或兩個二價金屬離子，常見的金屬離子有Zn²⁺、Co²⁺和Mn²⁺等，對酶的蛋白結構有穩定作用。氨肽酶也可根據底物分為三類：一是具有廣泛特異性的氨肽酶，比如亮氨酰氨基肽酶、膜和胞漿丙氨酰氨基肽酶等；二是具有狹窄特異性的氨肽酶，比如偏好堿性氨基酸底物的氨基肽酶B、偏好酸性氨基酸底物的谷氨酰氨基肽酶、天冬酰氨基肽酶、對特定氨基酸偏好的半胱氨酰氨基肽酶、蛋氨酰氨基肽酶、脯氨酰氨基肽酶等；三是切割氨基末端2-3個氨基酸短肽的酶。氨肽酶可作為風味蛋白酶，在烘焙、釀造和奶酪制作等食品加工過程中用于去除多肽的苦味；此外，氨肽酶可被應用于生物肽和氨基酸的合成，并被發現比化學合成更有效；而且，氨肽酶能夠水解有機磷化合物，因此具有營養學、生物學和生態學意義。目前，商業化的氨肽酶較少，水解位點較單一。挖掘新的氨肽酶，具有重要的應用和推廣價值。

球形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sphaericus)是一種產生芽孢的革蘭氏陽性菌。部分菌株對蚊蟲具有特異性毒殺作用、或抑制病原(真)菌甚至腫瘤細胞等能力；同時該種屬細菌具有特殊的代謝合成能力，在媒介蚊蟲的生物防治、能源利用和植物保護等領域展示了廣泛的應用前景。球形賴氨酸芽孢桿菌不能代謝糖類。與蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌相比，它具有更豐富的氨基酸轉運和代謝編碼基因。而且其野生型菌株中表達的殺蚊毒素蛋白占主導地位，其他蛋白產量較少。因此推測其氨基酸相關蛋白酶可能會具有較高活性，滿足自身對氨基酸的代謝需求。所以，可以利用球形賴氨酸芽孢桿菌的氨肽酶編碼基因。

發明內容

為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為一種球形賴氨酸芽孢桿菌C3-41來源的氨肽酶Amp0279，編碼基因核酸序列為SEQ ID NO:1所示。

而且，氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示。

一種含有所述的氨肽酶Amp0279編碼序列的重組質粒pHT43-amp0279，其特征在于：所述重組質粒pHT43-amp0279核酸序列為SEQ ID NO:4所示。

以及含有所述的重組質粒pHT43-amp0279的重組菌株。