[發明專利]精氨酸脫羧酶生產菌及其構建方法

在審

• 申請號: 202111164277.4
• 申請日: 2021-09-30
• 公開（公告）號: CN114085861A
• 公開（公告）日: 2022-02-25
• 發明（設計）人: 岳明瑞;謝沛;曹華杰;郭永勝
• 申請（專利權）人: 新泰市佳禾生物科技有限公司;汕頭市佳禾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12N9/88;C12R1/125
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 李茜

本發明公開了一種精氨酸脫羧酶生產菌及其構建方法，包括以下步驟：(1)對Pg3啟動子進行優化，將質粒pHT304用NdeⅠ和HincⅡ雙酶切處理，將優化后的Pg3啟動子整合在雙酶切處理后的質粒pHT304上，得到質粒pHT304?Pg3；(2)將步驟(1)得到的質粒pHT304?Pg3用SphⅠ和SacⅠ雙酶切處理，將SpeA基因整合到雙酶切處理后的質粒pHT304?Pg3上，得到重組表達載體；(3)將步驟(2)得到的重組表達載體導入到枯草芽孢桿菌上，構建得到精氨酸脫羧酶生產菌。本發明的生產菌提高了精氨酸脫羧酶的產量。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種精氨酸脫羧酶生產菌及其構建方法。

背景技術

胍基丁胺(Agmatine)又稱為鯡精胺，分子式C₅H₁₄N₄，一種內源性可樂定置換物質(clonidine displacing substance,CDS)，是咪唑啉受體的激動劑α₂-腎上腺素能受體的非兒茶酚胺配體。它存在于生物體多種組織和細胞中,在生物體代謝中起到重要作用，具有多種生物學功能。在心血管系統，胍基丁胺能降低心率、平均動脈壓、左室壓、外周血管阻力指數等；在泌尿系統，胍基丁胺能增加腎小球過濾率和絕對近端沖吸收；在胃腸道，胍丁胺能增加胃酸和胃蛋白酶的分泌，使粘膜厚度變薄，惡化應激引起的粘膜病變等；在糖代謝條件中，胍丁胺能增加胰島素的分泌，此外，近年的研究表明，胍基丁胺還能抑制多種細胞(包括血管平滑肌細胞、星型膠質細胞、內皮細胞、肝癌細胞和腎小管上皮細胞等)的增殖。隨著人們對胍基丁胺生理作用研究的深入，胍基丁胺顯示了廣闊的臨床應用前景，特別是在神經系統中的應用前景尤其引入注意。在食品、化工、藥物制備和臨床等領域，國內外需求巨大，市場應用前景廣闊。胍基丁胺的生產方法主要有化學法和生物酶法。化學法路線步驟多、收率低、成本高、不適合大規模的工業化生產。生物酶法主要是使用精氨酸脫羧酶(Argininedecarboxylase，EC 4.1.1.19)，這是一種5'-磷酸吡哆醛(輔酶PLP)依賴型的脫羧酶。該酶可以L-精氨酸為底物，經脫羧基后生成胍基丁胺。酶法生產胍基丁胺工藝簡單，周期短，耗能低，專一性強，收率高，提取方便。但是，在酶法生產胍基丁胺的過程中，如何獲得低成本高效的酶源是關鍵問題。

雖然精氨酸脫羧酶的來源在植物、動物和微生物體內廣為分布。但目前精氨酸脫羧酶主要還是通過化學合成法和微生物發酵法兩種制備得到，其中化學合成法因其步驟繁復、造成的污染嚴重，產物收率較低等缺點日益被微生物發酵法所取代。微生物發酵法是通過誘變菌株或重組工程菌株，讓微生物發酵產生精氨酸脫羧酶。所以如何構建精氨酸脫羧酶生產菌并能低成本高效的生產精氨酸脫羧酶是需要解決的問題。

發明內容

針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種精氨酸脫羧酶生產菌及其構建方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種精氨酸脫羧酶生產菌的構建方法，包括以下步驟：

(1)對Pg3啟動子進行優化，將質粒pHT304用NdeⅠ和HincⅡ雙酶切處理，將優化后的Pg3啟動子整合在雙酶切處理后的質粒pHT304上，得到質粒pHT304-Pg3；

(2)將步驟(1)得到的質粒pHT304-Pg3用SphⅠ和SacⅠ雙酶切處理，將SpeA基因整合到雙酶切處理后的質粒pHT304-Pg3上，得到重組表達載體；

(3)將步驟(2)得到的重組表達載體導入到枯草芽孢桿菌上，構建得到精氨酸脫羧酶生產菌。

優選的，步驟(1)中，優化后的Pg3啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

優選的，步驟(1)中，質粒pHT304-Pg3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

優選的，步驟(2)中，所述SpeA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。