[發明專利]一種誘導腫瘤細胞上皮間質轉化藥物的篩選探針及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202111163125.2
• 申請日: 2021-09-30
• 公開（公告）號: CN114317542A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 王穎銘;韓承剛;鄭楓;柳文媛;馮鋒
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C07D207/46;C09K11/06;G01N21/64;G01N33/574
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 邢賢冬;徐冬濤

1.一種誘導腫瘤細胞上皮間質轉化藥物的篩選探針，其特征在于：所述的篩選探針為在適配體SYL3C的5’端修飾在適配體SYL3C的3’端修飾6-羧基熒光素，形成的探針TPE-SYL3C-FAM。

2.根據權利要求1所述的誘導腫瘤細胞上皮間質轉化藥物的篩選探針，其特征在于：所述的篩選探針為在適配體SYL3C的5’端修飾氨基，在3’端修飾6-羧基熒光素，得到H₂N-SYL3C-FAM，再在H₂N-SYL3C-FAM的5’端氨基修飾四苯乙烯得到探針TPE-SYL3C-FAM。

3.一種權利要求1所述的誘導腫瘤細胞上皮間質轉化藥物的篩選探針的制備方法，其特征在于：包括：以水和DMSO的混合溶劑為反應溶劑，H₂N-SYL3C-FAM與[1-(4-羧基苯基)-1,2,2-三苯基]乙烯N-羥基琥珀酰亞胺酯反應得到探針。

4.根據權利要求3所述的誘導腫瘤細胞上皮間質轉化藥物的篩選探針的制備方法，其特征在于：所述的H₂N-SYL3C-FAM與[1-(4-羧基苯基)-1,2,2-三苯基]乙烯N-羥基琥珀酰亞胺酯的質量比為2:1～5:1。

5.根據權利要求3所述的誘導腫瘤細胞上皮間質轉化藥物的篩選探針的制備方法，其特征在于：所述的反應的溫度為4～37℃，反應的時間為12～24h。

6.根據權利要求3所述的誘導腫瘤細胞上皮間質轉化藥物的篩選探針的制備方法，其特征在于：反應結束后，反應液裝入截留分子量3kD的超濾離心管，超濾離心得到探針。

7.一種權利要求1所述的誘導腫瘤細胞上皮間質轉化藥物的篩選探針的制備方法，其特征在于：包括：配制濃度為5～10.5mg·mL^-1的H₂N-SYL3C-FAM水溶液，按照H₂N-SYL3C-FAM與[1-(4-羧基苯基)-1,2,2-三苯基]乙烯N-羥基琥珀酰亞胺酯的質量比為2:1～5:1，加入濃度為20mg·mL^-1的[1-(4-羧基苯基)-1,2,2-三苯基]乙烯N-羥基琥珀酰亞胺酯的DMSO溶液，攪拌反應，反應液超濾離心得到探針。

8.權利要求1所述的誘導腫瘤細胞上皮間質轉化藥物的篩選探針在篩選EMT相關的藥物的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于：所述的EMT相關的藥物為誘導上皮腫瘤細胞產生EMT副作用的藥物、拮抗EMT過程的化療增敏劑。

10.一種采用權利要求1所述的誘導腫瘤細胞上皮間質轉化藥物的篩選探針篩選EMT相關的藥物的方法，其特征在于：

EMT相關的藥物為誘導上皮腫瘤細胞產生EMT副作用的藥物時，包括：將可傳代的腫瘤細胞接種于黑色96孔板中，置于37℃、含5％CO₂的細胞培養箱中培養24h，棄去培養基，加入濃度為5μM待測藥物，37℃孵育24h，PBS清洗，加入由PBS緩沖液配制的濃度為10nM的權利要求1所述的探針溶液，孵育；以不含待測藥物的PBS緩沖液為空白對照組；以多功能酶標儀檢測器(λex＝306nm，λem＝445nm)測得熒光強度I₄₄₅/I₅₂₄；采用MTT法測定細胞活力；對待測藥物和空白對照組的熒光強度進行歸一化處理：

MTT歸一化熒光強度＝熒光強度/細胞活力；

與空白對照組相比，若待測藥物的MTT歸一化熒光強度降低，表示待測藥物誘上皮導癌細胞產生EMT轉化；

EMT相關的藥物為拮抗EMT過程的化療增敏劑時，包括：將可傳代的腫瘤細胞接種于黑色96孔板中，置于37℃、含5％CO₂的細胞培養箱中培養24h，棄去培養基，以無胎牛血清培養基饑餓細胞48h，PBS清洗，繼續以含5ng·mL^-1TGF-β1和1～10μM待測化療增敏劑的無胎牛血清培養基處理細胞48h，以只含5ng·mL^-1TGF-β1的無胎牛血清培養基培養細胞48h作為對照組；棄去培養基，PBS清洗，加入由PBS緩沖液配制的濃度為10nM的權利要求1所述的探針溶液，孵育；以多功能酶標儀檢測器(λex＝306nm，λem＝445nm)測得熒光強度I₄₄₅/I₅₂₄；采用MTT法測定細胞活力；對待測化療增敏劑和對照組的熒光強度進行歸一化處理：

MTT歸一化熒光強度＝熒光強度/細胞活力；

與對照組相比，若待測化療增敏劑的MTT歸一化熒光強度增加，表示待測化療增敏劑拮抗EMT過程。