[發明專利]一種適用于Pacbio三代長讀長測序的高質量滸苔DNA的提取方法

在審

• 申請號: 202111160712.6
• 申請日: 2021-09-30
• 公開（公告）號: CN113846090A
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發明（設計）人: 畢遠芝;何鵬;余小煒;李暉;趙仕蘭;肖云平;王樹偉
• 申請（專利權）人: 上海歐易生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 上海德禾翰通律師事務所 31319
• 代理人: 夏思秋

1.一種適用于Pacbio三代長讀長測序的DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取大片段滸苔DNA

1)將CTAB裂解液和β-巰基乙醇加入離心管中，然后55-70℃預熱；

2)將液氮研磨后的滸苔粉末倒入所述步驟1)預熱后的離心管中，迅速用手將管內液體搖勻；

3)向所述步驟2)中加入蛋白酶K和RNA酶A，用手將管內液體搖勻，置于55-70℃恒溫金屬浴中溫育30-90分鐘；

4)冷卻，然后加入預冷的體積比為25：24：1的酚：氯仿：異戊醇，用手搖勻后置于0-8℃放置1-15分鐘；

5)離心取上清，然后在上清中加入體積比為24：1的氯仿：異戊醇，用手搖勻，置于0-8℃放置1-30分鐘；

6)離心取上清，加入0.5-1倍上清體積的異丙醇，用手將離心管輕柔顛倒混勻，置于-20～-80℃冷凍10分鐘-2小時；

7)離心，用70％的乙醇洗滌沉淀，然后離心，去除上清，得大片段滸苔DNA；待所述滸苔DNA干燥后，用洗脫緩沖液溶解所述滸苔DNA；

(2)稀釋DNA并用磁珠純化DNA

8)向所述步驟7)中濃度低于50ng/μl的滸苔DNA中加入0.6×的純化磁珠，室溫靜止10分鐘；

9)然后置于磁力架上吸附5分鐘，去掉上清，用70％乙醇洗滌10秒，去掉上清，洗滌2次，去掉殘余酒精，從磁力架上取下離心管；

10)用洗脫緩沖液洗脫滸苔DNA，室溫靜置2分鐘后，置于磁力架上吸附5分鐘后，吸取上清置于新的離心管中，得到滸苔DNA。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，所述含有β-巰基乙醇的CTAB裂解液中β-巰基乙醇的終濃度為2％-6％。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，所述CTAB裂解液包括2％-3％的CTAB，1-2M的NaCl和50-200mM的Tris(pH8.0)，10-30mM的EDTA。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中，所述蛋白酶K的體積為10-30μl；所述RNA酶的體積為2-6μl；

和/或，所述步驟4)中，所述酚為pH8.0的tris飽和酚。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟5)-7)離心的條件均為：12000-14000rpm，0-6℃低溫離心5-30分鐘。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟7)中，所述大片段滸苔DNA是指片段長度大于50kb的滸苔DNA。

7.一種DNA抽提試劑盒，其特征在于，包括裂解液，蛋白酶K和RNA酶A。

8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述裂解液包含2％-3％的CTAB，1-2M的NaCl和50-200mM的Tris(pH8.0)，10-30mM的EDTA，使用前加入2％-6％的β-巰基乙醇。

9.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA抽提試劑盒中蛋白酶K和RNaseA的含量分別為10-30μl/樣本和2-6μl/樣本。

10.如權利要求7-9之任一項所述的DNA抽提試劑盒在提取DNA中的應用。