[發(fā)明專利]α-1,2-巖藻糖基轉移酶突變體及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111159897.9
• 申請日: 2021-09-30
• 公開（公告）號: CN113817701B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發(fā)明（設計）人: 周洪波;劉雯嫻;潘麗娜;朱玉玲;汪家琦;王玉光;陳祝;戴智勇;程海娜;顏衛(wèi)彬
• 申請（專利權）人: 中南大學;澳優(yōu)乳業(yè)（中國）有限公司;長沙運康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/18;C12P19/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及α?1,2?巖藻糖基轉移酶突變體及其應用。傳統(tǒng)認為乳糖并不是α?1，2?巖藻糖基轉移酶的天然底物，而本發(fā)明提供的α?1,2?巖藻糖基轉移酶突變體，通過定點突變改造α?1,2?巖藻糖基轉移酶獲得α?1,2?巖藻糖基轉移酶突變體，構建其基因工程菌并應用在高效催化巖藻糖基化寡糖生產(chǎn)中。α?1,2?巖藻糖基轉移酶經(jīng)替換多個氨基酸殘基能夠以乳糖為底物。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及α-1,2-巖藻糖基轉移酶突變體及其應用。

背景技術

α-1,2-巖藻糖基轉移酶屬于巖藻糖基轉移酶家族，催化鳥苷二磷酸活化的巖藻糖基轉移到半乳糖基連接的受體底物上，形成α-1,2-糖苷鍵。例如，GDP-L-巖藻糖和乳糖在α-1,2-巖藻糖基轉移酶的催化下可以生成2’-巖藻糖基乳糖，其在促進健康腸道菌群構建、免疫系統(tǒng)發(fā)育、過敏性疾病預防和大腦功能發(fā)展等方面發(fā)揮著極其重要的作用。

目前用于合成巖藻糖基化產(chǎn)物的方法包括化學法和生物法。化學法包括分離提取和從頭合成。分離提取是指從樣品中(如母乳)對巖藻糖基化寡糖進行分離和提純，這種方法受制于樣品的多少，且損失極大。從頭合成法是通過合成化學基團實現(xiàn)每個基團組裝，但這常常伴隨著反應步驟多、條件復雜不好控制、存在有毒有害試劑參與等問題。生物法包括全細胞發(fā)酵和酶法合成，因其條件溫和、專一性強等優(yōu)勢，是目前主要采用的方法。

目前巖藻糖基化產(chǎn)物合成主要是通過全細胞發(fā)酵，即通過在基因工程菌株中構建所需代謝途徑并轉入α-1,2-巖藻糖基轉移酶基因來實現(xiàn)產(chǎn)物合成。國外已有公司以該法實現(xiàn)了巖藻糖基化寡糖的商業(yè)化。而在我國，該法由于轉基因工程菌參與，尚未獲得行業(yè)應用批準。除此之外，全細胞發(fā)酵生產(chǎn)工藝的缺陷還表現(xiàn)在其最終產(chǎn)物的產(chǎn)量還處于較低水平，存在較大提升空間。這是由于現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的α-1,2-巖藻糖基轉移酶表現(xiàn)出的活性并不能滿足工業(yè)需求，極大程度限制了其大規(guī)模應用。

隨著人們對于巖藻糖基化產(chǎn)物的需求日益增加，運用基因工程技術改良、創(chuàng)制酶分子及其基因工程菌株以期獲得功能強化的α-1,2-巖藻糖基轉移酶成為了生物催化領域的發(fā)展趨勢。目前針對α-1,2-巖藻糖基轉移酶催化活性的改造還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供α-1,2-巖藻糖基轉移酶突變體及其應用，以期提高巖藻糖基轉移酶的活性，并擴大其底物識別范圍。

本發(fā)明提供的α-1,2-巖藻糖基轉移酶的突變體，其野生型的氨基酸序列如SEQ?IDNO:1所示，所述突變體包括如下突變位點中的至少一個：

N14M，Q15C，M16T，F(xiàn)17Y，F(xiàn)21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F(xiàn)94D，E95I，Y96S，L100F，F(xiàn)109I，G111N，Y112I，F(xiàn)113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，V172Y，I175F，C179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，N276Y，V283N，K284F或V291L。

一些實施例中，所述突變體的突變位點的數(shù)量為1～11。

一些具體實施例中，所述突變體中的突變位點為N14M、Q15C、M16T、F17Y、F21A、Q71S、L73K、V88N、S89A、F94D、E95I、Y96S、L100F、F109I、G111N、Y112I、F113R、Q114V、D115F、P116N、R117K、Y118T、V172Y、I175F、C179E、K206W、Y249C、S250T、W251N、W252I、A254F、Y255F、I264V、G266C、P267Y、H269W、L271?S、G273C、H274G、N276Y、V283N、K284F或V291L中的任意一個；

或為H269W和?V172Y；