[發明專利]基于生物酶法合成托品骨架化合物的方法及應用

在審

• 申請號: 202111158151.6
• 申請日: 2021-09-30
• 公開（公告）號: CN115896202A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 周志華;魏文蘋;吳世文;嚴興
• 申請（專利權）人: 中國科學院分子植物科學卓越創新中心
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12N15/70;C12N15/52;C12N15/54;C12N15/53;C12N1/21;C07D451/10;C07D491/147;C12R1/19
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明提供了一種基于生物酶法合成托品骨架化合物的方法及應用。本發明人通過挖掘植物基因組信息，提供了一系列分離的酶，包括4?香豆酸輔酶A、酰基轉移酶、莨菪?6?β?羥化酶。進一步地，本發明人通過聯合運用所述的酶，合成了山莨菪醇類似物或東莨菪醇類似物，以及它們的合成途徑的中間體化合物。

技術領域

本發明涉及生物技術和微生物學領域；更具體地，本發明涉及基于生物酶法合成托品骨架化合物的方法及應用。

背景技術

托品生物堿是來自茄科植物，其代表性化合物莨菪堿和東莨菪堿被世衛組織批準為抗膽堿藥物，已被廣泛用于麻醉、鎮痛、止咳以及控制帕金森病等。作為臨床基本藥物莨菪堿和東莨菪堿擁有巨大市場需求，而其來源十分有限。茄科植物顛茄的葉片中托品生物堿的含量很低，莨菪堿含量一般為0.2％，東莨菪堿含量一般為0.02％。由于立體化學的挑戰性，托品生物堿的全部化學合成方法對于工業用途而言都沒有足夠的經濟效益。植物育種者使用遺傳，輻射，和多倍體育種方法以嘗試開發新的植物品種以高含量的莨菪而聞名，但所有這些努力都失敗了。由此可見，東莨菪堿雖然具有極其重要的價值，但其來源存在一定的局限性。

據已有文獻報道：在石蒜堿的C2基團上進行了親脂取代可顯著增強乙酰膽堿酶抑制活性。由于含有托品烷骨架的肉桂酸和苯甲酸類酯具有廣泛的生物活性，一些被應用于制藥行業。如果可以快速獲得豐富多樣的托品骨架的類似物，將會大大提高托品生物堿的藥用活性潛能。

2016年，Dominique?Loqué等首次在酵母體內實現莨菪堿類似物的生物合成。他們在酵母體內通過喂養假托品醇和肉桂酸，利用擬南芥來源的At4CL和古柯來源的EcCS催化生成肉桂酰假托品醇。4香豆酸：輔酶A連接酶(4CL)是木質素生物合成途徑中的一個關鍵酶，4CL催化肉桂酸及其羥基或甲氧基衍生物生成相應的輔酶A酯，這些中間產物隨后進入苯丙烷類衍生物支路合成途徑。其中以四香豆酸、阿魏酸和芥子酸為底物生成的香豆酰CoA、阿魏酰CoA、芥子酰CoA，被進一步轉化為肉桂醇衍生物，最終通過脫氫還原反應生成木質素單體。EcCS酰基轉移酶，該酶以苯丙烷輔酶A酯為酰基供體，假托品醇為酰基受體生成酯。

2019年，Srinivasan和Smolke在文獻中指出EcCS也可以利用托品醇作為酰基受體，這進一步擴展了EcCS的底物范圍。Srinivasan和Smolke進一步將擬南芥的PAL1和4CL5以及來自于古柯的可卡因合酶基因(EcCS)轉化進入工程酵母細胞中，在酵母中進行莨菪堿的類似物肉桂酰托品的合成。

東莨菪堿比莨菪堿具有更高的應用價值，但東莨菪堿的類似物的生物合成在本領域中尚需進一步探討和優化。

發明內容

本發明的目的在于提供基于生物酶法合成托品骨架化合物的方法及應用，所述化合物包括新的化合物，包括非天然的化合物。

在本發明的第一方面，提供一種制備托品骨架化合物的方法，包括：以4-香豆酸輔酶A、酰基轉移酶、莨菪-6-β-羥化酶聯合，催化苯丙烷酸與托品醇類酰基受體合成托品骨架化合物，所述托品骨架化合物包括山莨菪醇類化合物或東莨菪醇類化合物。

在一個或多個實施方案中，所述的苯丙烷酸包括具有式(I)結構的化合物；和/或，所述托品醇類酰基受體包括：假托品醇或托品醇，山莨菪；

其中，R1，R2，R3獨立地選自：氫，羥基，-O-烷基(烷氧基)，烷基，羰基、醛基。

在一個或多個實施方案中，所述的山莨菪醇類化合物包括具有式(II)結構的化合物；和/或，所述的東莨菪醇類化合物包括具有式(III)結構的化合物；

在一個或多個實施方案中，所述的烷基為包括1～8個碳原子(如2、3、4、5、6或7個)的烷基；較佳地，所述的式(I)結構的化合物包括(但不限于)選自如下結構的化合物或其異構體：