[發(fā)明專利]一種基于mSNP技術(shù)檢測西葫蘆種子純度的混樣檢測方法

在審

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• 申請日: 2021-09-29
• 公開（公告）號: CN113755631A
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許彥芬;高苗;劉景藝;李凝;張萌;龔舒;郝軍會;劉田;張叢
• 申請（專利權(quán)）人: 石家莊博瑞迪生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11467
• 代理人: 郜彥茹

本發(fā)明涉及一種基于mSNP技術(shù)檢測西葫蘆種子純度的混樣檢測方法，其利用引物對1F/R～20F/R進(jìn)行，所述引物對1F/R～20F/R的基因序列見SEQ IDNo.1～40；本發(fā)明采用mSNP技術(shù)，在擴(kuò)增子不變的情況下，可以檢測到更多的SNP變異；采用混樣的方法進(jìn)行檢測，在減少擴(kuò)增工作量的同時降低了測序成本，也加快了檢測速度，可在一天時間內(nèi)最多完成1440粒種子的檢測。本方法是利用測序技術(shù)直接讀取單核苷酸多態(tài)，通過程序直接進(jìn)行純度結(jié)果的判讀，結(jié)果直觀，可靠，避免受種子發(fā)育期、及結(jié)果判讀時主觀因素的影響。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于種子純度檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于mSNP技術(shù)檢測西葫蘆種子純度的混樣檢測方法。

背景技術(shù)

西葫蘆(Cucubita pepoL.)是葫蘆科南瓜屬一年生植物，原產(chǎn)于北美洲南部，故又被稱為美洲南瓜。西葫蘆同時兼具營養(yǎng)價值和保健功能，受到大眾喜愛，在我國各地均有大面積的種植，是我國蔬菜的主要品種之一。除少量法國冬玉、美國碧玉等進(jìn)口品種以外，市場上的其他種子主要依靠國內(nèi)培育，制種區(qū)主要集中在我國西北和山西省北部。種子生產(chǎn)和貿(mào)易中種子質(zhì)量最重要的2個指標(biāo)就是種子純度和真實性。利用雜交優(yōu)勢來培育雜交新品種是目前育種常用的方法，在制種過程中由于人為因素等原因，經(jīng)常出現(xiàn)假雜交種，導(dǎo)致純子純度下降，故西葫蘆制種和售種單位每年都要進(jìn)行種子純度鑒定。

種子純度鑒定最傳統(tǒng)的方法還是田間種植，一般制種單位生產(chǎn)的雜交種的收獲時間是在10月中旬，然后對植株和果實的特征進(jìn)行鑒定；純度鑒定的結(jié)果要在春節(jié)之后才能拿到。這種鑒定方法工作量大、耗時長且成本很高。因此尋找快速、準(zhǔn)確、有效的品種純度鑒定方法是生產(chǎn)上急需解決的問題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，從DNA水平上對種子純度進(jìn)行鑒定和分析成為主流途徑。其中分子標(biāo)記技術(shù)是一種快速、準(zhǔn)確的種子純度鑒定的方法。常用的分子標(biāo)記有RFLP、RAPD、SSR、AFLP等。RFLP是1974年發(fā)明的分子標(biāo)記技術(shù)，在種子鑒定中具有重復(fù)性好、共顯性、不受生長發(fā)育階段影響等優(yōu)點；缺點是對系譜分析中提供信息不充分的，很難進(jìn)行鑒定、需要用到同位素一般檢測室難以進(jìn)行操作等。RAPD相對RFLP來說具有需要的DNA量較少、操作更加簡單、不需使用同位素等優(yōu)點；缺點是一般是顯性標(biāo)記不能對雜合型和純合型進(jìn)行區(qū)分、穩(wěn)定性差等。AFLP是1992年荷蘭Zabeau等發(fā)明的技術(shù)，該技術(shù)可以分析基因組較大的作物、多態(tài)性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過RFLP和RAPD等技術(shù)；缺點是需要同位素等。SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好；但是必須針對每個染色體座位的微衛(wèi)星發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列才能設(shè)計引物，引物開發(fā)的難度較大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種基于mSNP技術(shù)檢測西葫蘆種子純度的混樣檢測方法，其高效、準(zhǔn)確、成本低。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

技術(shù)方案一：

一種于mSNP技術(shù)的西葫蘆種子純度檢測的引物組，其特征在于，其包括引物對1F/R、引物對2F/R、引物對3F/R、引物對4F/R、引物對5F/R、引物對6F/R、引物對7F/R、引物對8F/R、引物對9F/R、引物對10F/R、引物對11F/R、引物對12F/R、引物對13F/R、引物對14F/R、引物對15F/R、引物對16F/R、引物對17F/R、引物對18F/R、引物對19F/R、引物對20F/R；其中每條引物對均由正向引物和反應(yīng)引物組成；

所述引物對1F/R中，F(xiàn)引物的序列SEQIDNo.1所示，R引物的序列如SEQIDNo.2所示；

所述引物對2F/R中，F(xiàn)引物的序列SEQIDNo.3所示，R引物的序列如SEQIDNo.4所示；

所述引物對3F/R中，F(xiàn)引物的序列SEQIDNo.5所示，R引物的序列如SEQIDNo.6所示；

所述引物對4F/R中，F(xiàn)引物的序列SEQIDNo.7所示，R引物的序列如SEQIDNo.8所示；