[發(fā)明專利]抗CK5/6蛋白單克隆抗體及其細(xì)胞株、制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111134257.2
• 申請日: 2021-09-27
• 公開（公告）號: CN113845592B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙普;楊清海;陳惠玲;王小亞;周洪輝;程本亮;陳昌星;林婷;李萍
• 申請（專利權(quán)）人: 福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/13;C12N5/20;G01N33/577;G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 福州市景弘專利代理事務(wù)所(普通合伙) 35219
• 代理人: 方圓;林祥翔

本發(fā)明涉及一種可以識(shí)別人CK5/6抗原的單克隆抗體，分泌細(xì)胞株、其制備方法以及其在免疫檢測中的用途。上述技術(shù)方案選取CK5/6蛋白C末端的488?590位氨基酸為抗原肽，進(jìn)行優(yōu)化，成為適合在大腸桿菌BL21表達(dá)的基因片段，最后得到的重組蛋白包含TRX蛋白標(biāo)簽、CK5/6蛋白片段及組氨酸蛋白標(biāo)簽。所述重組蛋白對小鼠進(jìn)行免疫，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選和亞克隆，獲得高效分泌抗CK5/6蛋白單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞株AbM58019?7H4,以及由該細(xì)胞株所分泌的抗CK5/6蛋白單克隆抗體。本方案得到的抗體具有高特異性、敏感性，可以特異性識(shí)別表達(dá)CK5/6蛋白的細(xì)胞，適用于免疫學(xué)檢測，特別是免疫組化檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，特別涉及一種抗CK5/6蛋白單克隆抗體及其細(xì)胞株、制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)胞角蛋白(CKs)家族是一組分布于上皮細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架中間纖維絲，其表達(dá)具有組織和器官特異性，主要在上皮細(xì)胞表達(dá)，共有20余個(gè)成員。細(xì)胞角蛋白5/6(cytokeratin5/6,CK5/6)是一種高分子量的細(xì)胞角蛋白，為高分子量的酸性多肽物質(zhì)，包含CK5和CK6兩種分子，主要表達(dá)于上皮及粘膜的鱗狀上皮，例如肺的鱗狀上皮、乳腺、前列腺及唾液腺的基底肌上皮細(xì)胞層。其作用和其他細(xì)胞角蛋白一樣,是維護(hù)上皮細(xì)胞的形態(tài)完整性。檢測腫瘤組織的CKs表達(dá)，可用以確定該腫瘤為上皮來源或確定上皮成份有無缺失。大部分單層腺上皮不表達(dá)CK5/6，對于鱗癌和腺癌有很好的鑒別診斷作用。

在正常乳腺導(dǎo)管基底細(xì)胞層上CK5/6蛋白常常表達(dá)。也有研究表明，CK5/6可以作為基底細(xì)胞樣型乳腺癌的特征性標(biāo)志物。文獻(xiàn)報(bào)道，表達(dá)CK5/6的乳腺癌患者的生存期是比較短的。還有研究報(bào)道，CK5/6已經(jīng)被認(rèn)為是乳腺癌獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。也有文獻(xiàn)報(bào)道在乳腺癌患者外周血中，CK5/6陽性細(xì)胞的表達(dá)與乳腺癌的分期是有關(guān)的，其可以作為臨床監(jiān)測和判斷預(yù)后的參考性指標(biāo)。目前CK5/6在分子分型中，它是已經(jīng)作為基底細(xì)胞樣型乳腺癌的特征性標(biāo)志物了。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明人提供了一種抗CK5/6蛋白單克隆抗體，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

進(jìn)一步地，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的DNA序列為SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的DNA序列為SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

進(jìn)一步地，所述單克隆抗體特異性識(shí)別CK5/6蛋白。

進(jìn)一步地，所述單克隆抗體為小鼠IgG2bκ亞型單克隆抗體。

進(jìn)一步地，所述單克隆抗體由保藏號為CGMCC NO 21982的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。

發(fā)明人又提供了一種抗CK5/6蛋白單克隆抗體的制備方法，其用于免疫小鼠的抗原為重組蛋白，所述重組蛋白由大腸桿菌重組表達(dá)，包含TRX蛋白標(biāo)簽、CK5/6蛋白片段及His蛋白標(biāo)簽。

進(jìn)一步地，所述CK5/6蛋白片段為CK5/6蛋白的488-590位氨基酸片段，其氨基酸序列為SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

發(fā)明人還提供了一株分泌抗CK5/6蛋白分子的雜交瘤細(xì)胞株，所述細(xì)胞株為小鼠雜交瘤細(xì)胞株AbM58019-7H4，所述細(xì)胞株已于2021年3月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO 21982，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。

發(fā)明人還提供了上述單克隆抗體在CK5/6蛋白免疫檢測中的用途。

進(jìn)一步地，所述免疫檢測包括免疫組織化學(xué)法，免疫印跡法和酶聯(lián)免疫法。