[發(fā)明專利]鹽湖浮游病毒快速熒光顯微計(jì)數(shù)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111133735.8
• 申請日: 2021-09-27
• 公開（公告）號: CN114112871A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊惠;吳穹;李建華;趙發(fā)明;王生蘭
• 申請（專利權(quán)）人: 青海大學(xué)
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 重慶知行合一專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50280
• 代理人: 蔣學(xué)琴

1.一種鹽湖浮游病毒快速熒光顯微計(jì)數(shù)方法，其特征在于，包括如下步驟，

步驟S100：樣品采集，使用無菌收集瓶浸入鹽湖水面以下取出水樣，立即加入戊二醛并置于4℃環(huán)境中避光固定保存；

步驟S200：雜質(zhì)祛除，在4℃環(huán)境中，用高速離心機(jī)離心處理步驟步驟S100保存的樣品，棄沉淀，取上清液，其中高速離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4000r/min，離心時(shí)間為5～10min；

步驟S300：二次離心，在4℃環(huán)境中，用高速離心機(jī)繼續(xù)離心處理步驟S200所得上清液5～10min，棄沉淀，繼續(xù)取上清液，然后用濾膜過濾得最終上清液，其中高速離心機(jī)轉(zhuǎn)速為6000r/min；

步驟S400：酶解游離核酸，取步驟S300所得上清液，放入無菌離心管，加入RNase A和DNase I，靜置20～30min；之后使用濾膜過濾，得過濾液；

步驟S500：染色，取步驟S400中的過濾液加入1x SYBR Green I，避光染色10~15min；再使用濾膜過濾，然后濾膜過濾抗腿色劑；

步驟S600：鏡檢，將步驟S500得到的濾膜放置載玻片上，根據(jù)熒光強(qiáng)度、顆粒大小區(qū)分細(xì)菌與病毒，隨機(jī)挑選若干視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鹽湖浮游病毒快速熒光顯微計(jì)數(shù)方法，其特征在于，步驟S100中鹽湖水樣與戊二醛的體積比為9：1。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種鹽湖浮游病毒快速熒光顯微計(jì)數(shù)方法，其特征在于，還包括步驟S700：計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果取平均值后根據(jù)稀釋倍數(shù)、視野面積、過濾面積計(jì)算浮游病毒的豐度；

計(jì)算公式如下:

其中，A為浮游病毒的豐度，單位為個(gè)/mL，n為單個(gè)視野下浮游病毒的平均數(shù)量，單位為個(gè)，Sm為濾膜面積，單位為mm²，Sf為顯微視野面積，單位為mm²，d為計(jì)數(shù)樣品稀釋倍數(shù)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一種鹽湖浮游病毒快速熒光顯微計(jì)數(shù)方法，其特征在于，所述濾膜為0.22μm的醋酸纖維濾膜。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一種鹽湖浮游病毒快速熒光顯微計(jì)數(shù)方法，其特征在于，所述步驟S600具體為將步驟S500得到的濾膜放置載玻片上，在10×100倍的油鏡下利用494 nm藍(lán)色激發(fā)光觀察；根據(jù)熒光強(qiáng)度、顆粒大小區(qū)分細(xì)菌與病毒，隨機(jī)挑選5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一種鹽湖浮游病毒快速熒光顯微計(jì)數(shù)方法，其特征在于，所述步驟S400中RNase A、DNase I的體積比分別為10000:1、5000:1。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一種鹽湖浮游病毒快速熒光顯微計(jì)數(shù)方法，其特征在于，所述步驟S500中1x SYBR Green I的體積比為40:1。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一種鹽湖浮游病毒快速熒光顯微計(jì)數(shù)方法，其特征在于，所述步驟S500中抗腿色劑體積比15:1。