[發(fā)明專利]條紋斑竹鯊單域抗體的多克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111132704.0
• 申請日: 2021-09-27
• 公開（公告）號: CN113683702B
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳錦霖;姜身飛;張坤;陳建明
• 申請（專利權(quán)）人: 閩江學(xué)院
• 主分類號: C07K16/42
• 分類號: C07K16/42;C07K16/06;G01N33/68
• 代理公司: 福州科揚(yáng)專利事務(wù)所(普通合伙) 35001
• 代理人: 郭夢羽

本發(fā)明公開了條紋斑竹鯊單域抗體的多克隆抗體的制備方法和應(yīng)用，屬于基因工程抗體技術(shù)領(lǐng)域，制備條紋斑竹鯊單域抗體的多克隆抗體時分別選取條紋斑竹鯊IgNAR可變區(qū)的氨基酸序列及IgNAR恒定區(qū)的氨基酸序列合成多肽，作為抗原，并經(jīng)過動物免疫后制備得到多克隆抗體Anti?vNAR和Anti?cNAR；本發(fā)明制得的條紋斑竹鯊單域抗體的多克隆抗體為今后鯊魚抗體的開發(fā)、利用及相關(guān)的研究提供有力的支持。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及條紋斑竹鯊單域抗體的多克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗體是指機(jī)體在抗原性物質(zhì)的刺激下所產(chǎn)生的免疫球蛋白，其能夠與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合。對于一般抗體而言，其結(jié)合抗原表位的部位由抗體的重鏈可變區(qū)(variabledomain of heavy chain，VH)和輕鏈可變區(qū)(variable domain of light chain，VL)共同構(gòu)成，但二者對于抗原結(jié)合的貢獻(xiàn)是不同的，一般情況下，重鏈可變區(qū)發(fā)揮主要作用，單獨(dú)的重鏈可變區(qū)仍具有抗原結(jié)合能力，但是輕鏈可變區(qū)的缺乏將使重鏈可變區(qū)對抗原的親和力降低，并且易于積聚和沉淀。傳統(tǒng)抗體來源主要包括鼠、兔和人等。1989年，Ward等(Nature 1989，341：544-546)首次制備了僅由抗體的VH區(qū)構(gòu)成的基因工程抗體，因?yàn)閮H由一個結(jié)構(gòu)域組成，故稱之為單域抗體(single domain antibody)。之后，通過克隆一般抗體的可變區(qū)而構(gòu)建的單域抗體在親和力和穩(wěn)定性等方面有了很大提高。

駝科動物和軟骨魚類等血清中不但存在常規(guī)的IgG抗體，同時還存在一種天然缺失輕鏈，僅有重鏈的IgG抗體，該類抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)僅由重鏈可變區(qū)的單一結(jié)構(gòu)域組成，被命名為重鏈抗體(VHH)或單域抗體，VHH同普通IgG抗體分子一樣保持了良好的、特異的抗原結(jié)合能力，是目前已知的具有完整抗體功能的最小分子片段，分子量僅為15kD，稱為納米抗體。重鏈抗體具有更長的抗原互補(bǔ)結(jié)合區(qū)，因此組織穿透性能力強(qiáng)，可以作用到一些普通抗體分子無法接觸的抗原部位，發(fā)揮抗體的功能。鯊魚的重鏈抗體被稱為IgNAR，由1個可變結(jié)構(gòu)域(vNAR)與5個恒定結(jié)構(gòu)域(cNAR)組成，將可變結(jié)構(gòu)域重組表達(dá)，即可獲得具有完整功能的抗體分子片段，為鯊魚的單域抗體。與傳統(tǒng)的抗體相比，鯊魚單域抗體具有組織滲透性好、穩(wěn)定性高、制備成本低廉和生產(chǎn)周期短等獨(dú)特優(yōu)勢。

目前，關(guān)于鯊魚單域抗體的研究基本上是集中在單域抗體的應(yīng)用、表達(dá)和檢測，例如分子探針的開發(fā)、疾病診斷試劑盒以及治療藥物的研制。然而，由于市場上缺乏鯊魚單域抗體的二抗，這就導(dǎo)致對鯊魚單域抗體的制備、研究和應(yīng)用都造成了限制，主要體現(xiàn)在：其一，目前單域抗體的篩選和制備主要通過免疫法，即以抗原對動物進(jìn)行多次免疫，再建立免疫抗體庫進(jìn)行靶向篩選，在此過程中，抗體血清效價是檢測免疫應(yīng)答，以及確定抗體庫時機(jī)的重要指標(biāo)，但是，由于缺乏特異的二抗，目前尚無方法對免疫過程中的抗體血清效價進(jìn)行有效的監(jiān)測；其二，目前鯊魚單域抗體通常攜帶標(biāo)簽蛋白，如His、Flag、GST或HA等，再以標(biāo)簽抗體為二抗進(jìn)行檢測，但是，該方法的使用可能導(dǎo)致鯊魚單域抗體失去其獨(dú)特的優(yōu)勢；例如，由于動物組織的蛋白組中具有相當(dāng)部分的蛋白質(zhì)中存在多個His串聯(lián)的情況，使用His標(biāo)簽抗體會產(chǎn)生非特異性結(jié)合，因此，帶有His標(biāo)簽蛋白的單域抗體就不宜用于免疫檢測中；此外，由于GST、MBP等標(biāo)簽蛋白分子量較大，這些標(biāo)簽蛋白的使用不僅使得單域抗體失去其“小”的優(yōu)勢，同時很可能導(dǎo)致其抗體功能及活性發(fā)生改變。

因此，亟需開發(fā)一種針對于鯊魚單域抗體的多克隆抗體，以期為今后鯊魚單域抗體的開發(fā)、利用及相關(guān)的研究提供有力的支持。

發(fā)明內(nèi)容

為了提供針對于與鯊魚單域抗體的多克隆抗體，以支持單域抗體的開發(fā)、利用及研究，本申請創(chuàng)造性地提出條紋斑竹鯊單域抗體的多克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用，以克服由于鯊魚單域抗體的二抗的缺少導(dǎo)致的制備和應(yīng)用的限制。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：