[發明專利]一種N端序列元件在調控釀酒酵母蛋白表達中的應用

有效

• 申請號: 202111129674.8
• 申請日: 2021-09-26
• 公開（公告）號: CN113736789B
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發明（設計）人: 劉延峰;堵國成;王晨蕓;劉龍;呂雪芹;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/81;C12N15/12;C12N15/67;C12N1/19;C07K14/435;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種N端序列元件在調控釀酒酵母蛋白表達中的應用，屬于基因工程領域。本發明提供了可用于調控目的蛋白表達量的調控元件，可以提高或降低基因在釀酒酵母中的表達量。以綠色熒光蛋白為例，按照本發明的方法構建的重組釀酒酵母，N端添加SEQ?IDNO.1～7所示的核苷酸序列，可使熒光強度由742提高至2310～11957，可達對照的16.11倍。N端添加SEQ?ID?NO.8～10所示的核苷酸序列，可使熒光強度由742降低至25～461，達到抑制目的蛋白表達的效果。

技術領域

本發明涉及一種N端序列元件在調控釀酒酵母蛋白表達中的應用，屬于基因工程領域。

背景技術

釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)屬于真核生物、兼性厭氧菌，是一種常用的代謝調控模式菌株，也是目前研究最為深入的真核微生物之一。釀酒酵母具有諸多優點，如遺傳背景清晰、易于代謝調控研究；遺傳穩定性高、不易發生基因突變或菌種退化；擁有較寬的底物譜、可以在各種探源條件下快速生長；有較完善的轉錄表達及分析方法等。與此同時，釀酒酵母被FDA組織確定為食品級安全微生物，也是全世界公認安全(GenerallyRecognized?as?Safe，GRAS)的微生物。由此，釀酒酵母被認為是一種具有巨大改造潛力的微生物細胞工廠，被廣泛用作底盤微生物來進行乙醇及高附加值產物的生產，在生物醫藥、化妝品、食品保健等各個領域具有廣闊的應用前景。

代謝途徑調控作為代謝工程以及合成生物學的核心，可以在轉錄水平、翻譯水平、蛋白質水平進行不同程度的調節，但能夠應用于釀酒酵母的調控元件非常有限，目前最常用元件可分為啟動子、轉錄因子的“輸入”控制，以及基于終止子的“輸出”控制。目前已有研究證明，在原核生物及真核生物中，基因N-端序列能在翻譯水平上調控基因的表達量。因此，將N端序列作為一種新型調控元件控制基因表達，豐富了酵母的調控元件庫，對酵母的代謝工程改造起到了促進作用。

發明內容

本發明提供了基因表達調控元件在調控目的蛋白在釀酒酵母中表達方面的應用，所述基因表達調控元件具有SEQ?ID?NO.1～10任一所示的核苷酸序列；所述基因表達調控元件被插入至目的蛋白編碼基因的N端，且位于目的蛋白起始密碼子ATG之后。

在一種實施方式中，所述基因表達調控元件具有SEQ?ID?NO.1～7任一所示的核苷酸序列，用于提高目的蛋白的表達量。

在一種實施方式中，所述基因表達調控元件具有SEQ?ID?NO.8～10所示的核苷酸序列，用于降低目的蛋白的表達量。

在一種實施方式中，所述目的基因連接至重組表達質粒pEBS中，再轉化到釀酒酵母中。

在一種實施方式中，所述目的蛋白包括但不限于綠色熒光蛋白。

在一種實施方式中，編碼所述綠色熒光蛋白的基因的GenBank登錄號為AF324408.1。

在一種實施方式中，以pEBS為表達載體，將具有調控功能的N端編碼序列連接在目的蛋白的N端，表達在釀酒酵母中。

在一種實施方式中，所述釀酒酵母為Saccharomyces?cerevisiae?S288C。

在一種實施方式中，所述pEBS已公開于論文《Construction?andCharacterization?of?Broad-Spectrum?Promoters?for?Synthetic?Biology》中。

本發明還提供了可使目的基因表達能力提高的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列是沿5’→3’方向，在基因序列的起始密碼子ATG之后插入基因表達調控元件；所述基因表達調控元件含有SEQ?ID?NO,1～10任一所示的序列。

在一種實施方式中，所述多核苷酸序列是以Genbank登錄號為AF324408.1的基因為出發序列，在起始密碼子ATG之后插入了SEQ?ID?NO.1～10任一所示的序列。