[發明專利]一種無乳鏈球菌表面免疫原性重組蛋白及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 202111124567.6
• 申請日: 2021-09-25
• 公開（公告）號: CN113735949A
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 吳允昆;朱春華;張娜;肖方南;張紅;王晶晶;景鼎鼎
• 申請（專利權）人: 福建師范大學
• 主分類號: C07K14/315
• 分類號: C07K14/315;C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;A61K39/09;A61K9/51;A61K47/04;A61P31/04;B82Y5/00;B82Y40/00;A23K20/147;A23K20/163;A23K40/30;A23K50/8
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 王義星

1.一種無乳鏈球菌表面免疫原性重組蛋白，其特征在于：所述重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根據權利要求1所述的無乳鏈球菌表面免疫原性重組蛋白的編碼基因，其特征在于：所述編碼基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一種包含權利要求2所述編碼基因的表達載體。

4.由權利要求3所述的表達載體轉化的宿主細胞。

5.如權利要求1所述的無乳鏈球菌表面免疫原性重組蛋白的制備方法，其特征在于：

將權利要求1所述的重組蛋白的編碼基因構建到表達載體上，獲得重組表達載體；將重組表達載體轉化宿主細胞，培養轉化的宿主細胞，使轉化的宿主細胞表達產生所述無乳鏈球菌表面免疫原性重組蛋白，之后回收并純化所表達的無乳鏈球菌表面免疫原性重組蛋白；

所述編碼基因是以羅非魚鏈球菌SIP蛋白基因序列為模板、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4為引物進行PCR擴增得到的。

6.如權利要求1所述的無乳鏈球菌表面免疫原性重組蛋白在制備羅非魚抗無乳鏈球菌感染的疫苗中的應用。

7.一種羅非魚口服納米疫苗，其特征在于：它是以權利要求1所述的無乳鏈球菌表面免疫原性重組蛋白作為抗原。

8.如權利要求7所述的羅非魚口服納米疫苗的制備方法，其特征在于：它包括以下步驟：

(1)制備MSN納米顆粒；

(2)制備SIP-MSN納米顆粒：將步驟(1)所得的MSN納米顆粒與權利要求1所述的無乳鏈球菌表面免疫原性重組蛋白的溶液混合均勻后，置于多用途旋轉搖床上，并在4-8℃混合10-12h，之后離心，回收沉淀，沉淀經冷凍干燥后即得所述SIP-MSN納米顆粒；

(3)制備羅非魚口服納米疫苗：在SIP-MSN納米顆粒表面包上羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯腸溶包衣，得SIP-MSN@HP55納米顆粒，即所述羅非魚口服納米疫苗。

9.根據權利要求8所述的羅非魚口服納米疫苗的制備方法，其特征在于：步驟(2)的具體操作方法為：將步驟(1)所得的MSN納米顆粒重懸在水中，形成MSN納米顆粒懸濁液；接著在權利要求1所述的無乳鏈球菌表面免疫原性重組蛋白的溶液中加入一定體積的MSN納米顆粒懸濁液，使得加入的MSN納米顆粒達到1mg，混合均勻后，再放在多用途旋轉搖床上，并在控溫為4-8℃的冷室混合10-12h；之后離心，回收沉淀，沉淀經冷凍干燥后即得所述SIP-MSN納米顆粒，并檢測離心所得的上清蛋白濃度，計算蛋白的負載量和負載率。

10.根據權利要求8所述的羅非魚口服納米疫苗的制備方法，其特征在于：步驟(3)的具體操作方法為：將步驟(2)所得的SIP-MSN納米顆粒重懸在水中，得SIP-MSN納米顆粒懸濁液；接著在SIP-MSN納米顆粒懸濁液中，加入PEG400作為蛋白保護劑后，再加入司班80作為乳化劑，加入二氯甲烷、乙酸乙酯，混勻；接著，在細胞破碎儀中超聲乳化后，迅速倒入0.1％PVA中，超聲清洗儀超聲3min乳化后，再迅速轉移倒入另一0.1％PVA中，將燒杯放在磁力攪拌機勻速攪拌，在溶液中滴加0.5％HP55，攪拌至有機溶劑揮發；離心收集沉淀，產物用去離子水洗2遍。