[發明專利]用于擴增或檢測新型冠狀病毒SARS-CoV-2核酸的引物組及其應用

在審

• 申請號: 202111117248.2
• 申請日: 2021-09-23
• 公開（公告）號: CN113684320A
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 羅震;吳建國;劉為勇;李永奎;葉春紅;譚秋萍;劉衛;高道龍
• 申請（專利權）人: 佛山病原微生物研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 張曉博

本申請公開了用于擴增或檢測新型冠狀病毒SARS?CoV?2核酸的引物組及其應用。該引物組以新型冠狀病毒SARS?CoV?2的N基因為靶基因進行設計，基于環介導等溫擴增技術的高特異性、高敏感性和便捷的優勢，提供了一套新型冠狀病毒恒溫快速核酸擴增的試劑盒，利用該試劑盒能夠快速準確地檢測新型冠狀病毒，具有廣泛應用前景。

技術領域

本申請涉及核酸擴增技術領域，尤其涉及用于擴增或檢測新型冠狀病毒SARS-CoV-2核酸的引物組及其應用。

背景技術

新型冠狀病毒屬于巢狀病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)，具有目前發現的一類最大的RNA病毒的特點，其基因組包含16個非結構蛋白基因(NSPs)和4個結構蛋白基因(S，M，E和N蛋白)。通常采用熒光定量PCR法擴增其N基因和ORF1ab基因。

但是，由于熒光定量PCR法的檢測需要技術嫻熟的技術人員、精確的檢測儀器和昂貴緊缺的試劑作為條件，不能實現對其核酸進行快速擴增和分析。

環介導恒溫擴增技術(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是2000年由日本學者Notomi開發的一門新興的基因擴增技術，具有特異性強、靈敏性高、等溫高效、操作簡便、成本低廉等優點。但由于LAMP擴增是鏈置換合成，靶序列長度在300bp以內，大于500bp則較難擴增，故不能進行長鏈DNA的擴增。由于靈敏度高，極易受到污染而產生假陽性結果，因此特別注意嚴謹操作，來防范非特異性擴增與污染。

發明內容

有鑒于此，本申請的目的在于仍然使用LAMP-PCR技術，提供一種能夠擴增長度大于500bp(如新型冠狀病毒N基因cDNA序列長度大于500bp)的靶序列，且能夠減少非特異性擴增與污染的問題。為此，本申請提供以下技術方案，能夠在一定程度上解決這些問題中至少一個。

本申請實施例第一方面提供一種用于擴增或檢測新型冠狀病毒SARS-CoV-2核酸的引物組，包括第一引物對、第二引物對和第三引物對；

所述第一引物對包括如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列及如SEQID NO.31～32所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的如SEQ IDNO.31～32所示的核苷酸序列功能相同或相似的核酸序列；

所述第二引物對包括如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列及如SEQID NO.33～34所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的如SEQ IDNO.33～34所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

所述第三引物對包括如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列及如SEQID NO.35～36所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的如SEQ IDNO.35～36所示的核苷酸序列功能相同或相似的核酸序列。

在本申請實施例中，所述新型冠狀病毒N基因的反轉錄cDNA序列如SEQ ID NO.37所示，所述引物組靶向如SEQ ID NO.37所示序列的12～213nt區。

本申請實施例第二方面還提供用于擴增或檢測新型冠狀病毒SARS-CoV-2核酸的反應體系，包括所述引物組。

在本申請實施例中，所述的反應體系還包括Bst DNA聚合酶、dNTPs、耐高溫轉錄酶、海藻糖、(NH)₄SO₄、可視化熒光染料、牛磺酸、Tris-HCl、TrionX-100和含Mg²⁺的反應緩沖液中的至少一種。