[發明專利]一種產戊二胺的重組大腸桿菌及其應用

有效

• 申請號: 202111110911.6
• 申請日: 2021-09-23
• 公開（公告）號: CN113817762B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 王昕;廖楊;陳可泉;王靜;朱強強;王靜雯;徐雙;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/64;C12N15/60;C12N15/54;C12N15/31;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 南京擎天知識產權代理事務所(普通合伙) 32465
• 代理人: 涂春春

本發明公開了一種產戊二胺的重組大腸桿菌及其應用。本發明從頭合成紅螺菌中的二磷酸核酮糖羧化酶基因、菠菜中的磷酸核糖激酶基因和賴氨酸脫羧酶基因，PCR拷貝大腸桿菌分子伴侶基因，構建質粒pTrc99a?cadA?cbbM和質粒pCWJ?prkA?GroEL/GroES，雙質粒重組菌在特定培養基中生長良好，葡萄糖被高效利用。在不同時間段分別加入誘導劑阿拉伯糖和IPTG，異源基因表達穩定，反應體系簡單、條件溫和、周期短、副產物少，而且清潔無污染，是一條簡單、快速、高效的生產途徑，從發酵結果中可以看出，重組大腸桿菌KACCPG產量有著明顯的提高。

技術領域

本發明屬于戊二胺制備領域，具體涉及一種產戊二胺的重組大腸桿菌及其應用。

背景技術

通過DNA重組技術改造具有生產L-賴氨酸能力的棒桿菌屬和埃希桿菌屬的細菌，現已實現工業化生產。賴氨酸脫羧酶可以將L-賴氨酸脫去一個羧基生成1,5-戊二胺和CO₂。例如，在大腸桿菌(E.coli)中，1,5-戊二胺是通過兩種賴氨酸脫羧酶多肽CadA和LdcC直接從L-賴氨酸生物合成的。1,5-戊二胺作為重要的化工中間體，被用于制備多種新型材料及高聚物，在工業生產中具有很高的應用價值。

但是，目前L-賴氨酸發酵生產1,5-戊二胺的路徑中，1,5-戊二胺產量有限且收率較低，同時生物制造戊二胺過程中產生的CO₂不僅大大降低了產品的原子經濟性，還增加了對環境的污染。因此，亟需開發一種具有較高收率的生產戊二胺（尸胺）的方法。

有研究表明在大腸桿菌中異源表達卡爾文循環途徑的二磷酸核酮糖羧化酶基因cbbM和磷酸核糖激酶基因prkA能夠促進工程菌生長，同時提升產量。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種產戊二胺的重組大腸桿菌及其應用，該方法為一種清潔高效的戊二胺生物發酵方法，催化合成周期短，成本低，適合產業化大規模生產戊二胺。

一種產戊二胺的重組大腸桿菌，包括以下步驟：

步驟1，先合成賴氨酸脫羧酶基因cadA，并構建質粒pTrc99a-cadA；再合成二磷酸核酮糖羧化酶基因cbbM，并將二磷酸核酮糖羧化酶基因cbbM與質粒pTrc99a-cadA連接，得到質粒pTrc99a-cadA-cbbM，最后轉入克隆載體Trans1-T1，經過LB平板初篩后，選取平板上生長的單菌落進行PCR驗證,再將陽性菌株送測；

步驟2，先合成磷酸核糖激酶基因prkA，并構建質粒pCWJ-prkA；再以商業化質粒pGRO7為來源，復制大腸桿菌分子伴侶基因GroEL/GroES，并將分子伴侶基因GroEL/GroES與質粒pCWJ-prkA連接，得到質粒pCWJ-prkA-GroEL/GroES，最后轉入克隆載體Trans1-T1，經過LB平板初篩后，選取平板上生長的單菌落進行PCR驗證,再將陽性菌株送測；

步驟3，將重組質粒pTrc99a-cadA-cbbM和pCWJ-prkA-GroEL/GroES轉入高產賴氨酸的大腸桿菌KA30中，即得重組大腸桿菌KACCPG；所述基因cadA的核苷酸序列如SEQ?NO.1所示；基因cbbM的核苷酸序列如SEQ?NO.2所示；基因prkA的核苷酸序列如SEQ?NO.3所示；基因GroEL/GroES的核苷酸序列如SEQ?NO.4所示。

作為改進的是，所述引物中cadA基因上游引物帶有 NdeI?酶切位點，下游引物帶有 BamHI酶切位點；cbbM基因上游引物帶有 BamHI?酶切位點，下游引物帶有 HindⅢ酶切位點。