[發明專利]用于ATP檢測的細胞裂解液及其應用

有效

• 申請號: 202111109674.1
• 申請日: 2021-09-23
• 公開（公告）號: CN113564225B
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發明（設計）人: 樓建榮;楊翔;謝桂華;黃婷
• 申請（專利權）人: 廣州市雷德生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/66
• 分類號: C12Q1/66;C12Q1/00
• 代理公司: 廣州市諾豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44714
• 代理人: 許飛

本發明屬于生物技術領域，公開了用于ATP檢測的細胞裂解液及其應用，細胞裂解液通過在緩沖液中添加TritonX?100、EDTA和NaCl等制備得到。本發明一些實例的細胞裂解液，可以在裂解細胞的同時并很好地穩定其中的ATP，裂解后的樣品可以穩定保存于2～8℃的環境下，有助于獲得更為準確的ATP檢測結果，存儲條件易滿足。與現有的細胞裂解液相比，其檢測的穩定性得到了大幅度提升，且操作方便，易于配制，且成本較低等優點。本發明一些實例的細胞裂解液，裂解液本身可穩定保存于2?8℃，存儲條件易滿足，使用時不需要反復凍融。

技術領域

本發明涉及生物領域，特別涉及一種用于ATP檢測的細胞裂解液及其應用。

背景技術

免疫功能由免疫細胞來完成，通過監測個體的免疫細胞，可為個體的免疫功能評估提供依據。ATP測定法是一種快速又靈敏的測定免疫細胞功能的方法，活化后淋巴細胞內ATP的含量可以反應細胞的免疫狀態。其中，活化后淋巴細胞需要進行細胞裂解后，才能測定淋巴細胞內的ATP含量。使用過程中，通過在全血中加入刺激物進行孵育后，用CD4抗體磁珠免疫分選出CD4細胞，使用磁力架洗滌出選定的CD4細胞后，加入裂解液和熒光素酶-熒光素底物，釋放細胞內ATP并通過化學發光免疫分析儀進行熒光值的測定。

ATP是一種易于被生物酶利用的能量分子，因此ATP測定法中的細胞裂解需要考慮多種因素，不僅需要能完全有效地對細胞進行裂解，而且需要抑制胞內ATP降解酶的活性，從而令胞內ATP的檢測值在一定檢測時間內保持穩定，達到穩定檢測，并且，其不能對后續ATP生物熒光法檢測的整個反應體系產生影響。這對細胞裂解提出了更高的要求。

目前，細胞裂解的方法主要包括：反復凍溶法（熱休克法）、超聲破碎法和裂解液處理法等。反復凍溶法以及超聲破碎法需要專業的儀器，對檢測的推廣應用有較多限制，而且其無法有效抑制胞內ATP降解酶的活性，使得細胞裂解后胞內ATP含量檢測值下降快，無法在一定的檢測時間內達到穩定檢測。裂解液處理法屬于較為溫和的方法，也應用最為廣泛。細胞裂解液通過去污劑破壞脂質雙分子層、破裂細胞；溶解蛋白；蛋白變性使其穩定；抑制蛋白酶活性。不同的實驗目的，裂解液的組分有所不同。

CN110702476A公開了一種ATP體外磷酸化樣本制備方法，其使用的細胞裂解液組成為20mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA和1vol.％Triton X-100，并加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，需要于-20℃下保存裂解后的樣本。

商品化的細胞裂解液有多種，可以較為高效地裂解細胞，然而專用于ATP檢測的細胞裂解液較少。常見的商品化ATP檢測試劑有碧云天S0026，裂解后樣品中的ATP在室溫不太穩定，需在4℃或冰上操作。其他商品化的ATP裂解液也存在類似的問題，這導致ATP的檢測結果受時間影響巨大，無法達到穩定檢測，檢測結果不夠準確。另外，大部分針對ATP檢測優化的裂解液需要保存在-20℃（如Sigma-Aldrich旗下的ATP生物發光測定試劑盒，要求儲存于-20℃）。儲存要求較高，使用時需要反復凍融，使用不便。

開發出一種可以有效維持裂解液中ATP穩定的細胞裂解液，對于準確測定細胞中ATP的量有著非常重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的至少一個不足，提供一種特別適用于ATP檢測的細胞裂解液及其應用。

本發明所采取的技術方案是：

本發明的第一個方面，提供：

一種用于ATP檢測的細胞裂解液，其基礎液為緩沖液，所述基礎液中添加了0.1～1v/v % TritonX-100、5～15 mM的EDTA、100～150 mM的NaCl。

在一些實例中，所述緩沖液選自HEPES、Tricine、Tris緩沖液中的一種。

在一些實例中，所述緩沖液為Tricine緩沖液，濃度為25～100 mM。