[發(fā)明專(zhuān)利]一種分泌氟啶草酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111109052.9
• 申請(qǐng)日: 2021-09-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113684187B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胥傳來(lái);路倩倩;匡華;徐麗廣;孫茂忠;劉麗強(qiáng);宋珊珊;吳曉玲;郝昌龍;胡擁明;吳愛(ài)紅;馬偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/20;C07K16/44;C07K14/765;C07K14/795;C07K14/77;G01N33/53;G01N33/577
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明涉及一種分泌氟啶草酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為單克隆細(xì)胞株LKS，于2021年05月13日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC?No.22324。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株可以高效且穩(wěn)定地分泌氟啶草酮單克隆抗體，應(yīng)用于氟啶草酮的免疫分析檢測(cè)時(shí)具有較好的靈敏度和特異性，ICsubgt;50/subgt;值為0.86ng/mL，對(duì)氟啶草酮類(lèi)似物交叉率小于10％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分泌氟啶草酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

氟啶草酮(Fluridone)屬于吡咯烷酮類(lèi)除草劑，可用于小麥、水稻、玉米、棉花、牧場(chǎng)和非耕地等，用于防除一年生禾本科雜草，闊葉雜草及某些多年雜草，還適用于某些對(duì)草甘膦產(chǎn)生抗性的雜草，是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，可被植物的根吸收并傳導(dǎo)至葉片，其作用機(jī)理是抑制番茄紅素脫氫酶，導(dǎo)致植物體內(nèi)的類(lèi)胡蘿卜素生物合成減少，從而引起葉綠素?fù)p耗，最終抑制光合作用造成植物死亡。目前，有關(guān)氟啶草酮在動(dòng)植物中的殘留有較多的研究。美國(guó)已經(jīng)規(guī)定了其在奶、蛋、棉籽等30多種農(nóng)產(chǎn)品中的殘留限量，因此，研究建立氟啶草酮的殘留檢測(cè)方法具有重要意義。

對(duì)于氟啶草酮?dú)埩舻臋z測(cè)，常采用儀器分析方法。但這些方法存在樣品前處理復(fù)雜和檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，不適用于大量樣品的快速檢測(cè)，因此，有必要建立一種針對(duì)氟啶草酮的高效、快速的檢測(cè)方法。

酶聯(lián)免疫法(ELISA)是一種極為高效、敏感、快速的檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)對(duì)樣本的前處理簡(jiǎn)單、純化步驟少、分析容量大、檢測(cè)成本低而且操作簡(jiǎn)便，適用于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，因此在農(nóng)藥殘留分析中得到了廣泛應(yīng)用。而使用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)氟啶草酮的前提是得到對(duì)氟啶草酮具有高特異性和高靈敏度的單克隆抗體，因此，找到一種制備對(duì)氟啶草酮具有高特異性和高靈敏度的單克隆抗體的方法十分關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種分泌氟啶草酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法，并應(yīng)用該菌株及其產(chǎn)生的單克隆抗體進(jìn)行氟啶草酮的檢測(cè)。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種分泌氟啶草酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為單克隆細(xì)胞株LKS，于2021年05月13日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC?No.22324。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，包括以下步驟：

S1：將氟啶草酮完全抗原制備成弗氏佐劑與不完全弗氏佐劑，后將弗氏佐劑注射入免疫動(dòng)物體內(nèi)，首次免疫采用完全弗氏佐劑，加強(qiáng)免疫采用不完全弗氏佐劑；

其中，氟啶草酮完全抗原由氟啶草酮半抗原制備得到，氟啶草酮半抗原的結(jié)構(gòu)如式I所示；

S2：對(duì)經(jīng)過(guò)上述免疫過(guò)程的免疫動(dòng)物進(jìn)行采血，檢測(cè)免疫動(dòng)物的血清免疫效價(jià)和免疫抑制能力，篩選出血清中氟啶草酮抗體含量高的免疫動(dòng)物；

S3：將篩選出的免疫動(dòng)物用不完全弗氏佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，然后采用不含弗氏佐劑的氟啶草酮完全抗原進(jìn)行沖刺免疫；

S4：將沖刺免疫后的免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合并進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞孔并測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞孔的抑制效果，對(duì)有最好抑制效果的陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行亞克隆，得到分泌氟啶草酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；

進(jìn)一步地，氟啶草酮完全抗原由氟啶草酮半抗原活化后與鑰孔血藍(lán)蛋白或牛血清蛋白偶聯(lián)得到，氟啶草酮完全抗原的結(jié)構(gòu)如式II所示：

進(jìn)一步地，使用N-羥基琥珀酰亞胺活化氟啶草酮半抗原。

進(jìn)一步地，整個(gè)免疫過(guò)程包括1次首次免疫、4-5次加強(qiáng)免疫和1次沖刺免疫。