[發明專利]合成阿福豆素和兒茶素的釀酒酵母菌株及其應用

有效

• 申請號: 202111106294.2
• 申請日: 2021-09-22
• 公開（公告）號: CN113846026B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發明（設計）人: 周景文;孫程程;徐沙;曾偉主;余世琴;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12P17/06;C12P17/16;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發明公開了合成阿福豆素和兒茶素的釀酒酵母菌株及其應用，屬于基因工程技術領域。本發明將F3H，F3’H和CPR整合至釀酒酵母基因組，得到了阿福豆素和兒茶素前體的從頭合成菌株，通過篩選確定了來源于F.xananassa的FaDFR和來源于V.s vinifera的VvLAR有最好的催化活行，并且通過連接肽的使用極大地促進了向阿福豆素和兒茶素的代謝通量，并且利用GAL7p和ERG1p啟動子啟動基因的表達，最后在阿福豆素從頭合成菌株AF12中中過表達TYR1，在兒茶素從頭合成菌株AF13中過表達TYR1、ARO8和ZWF1，進一步地提升了阿福豆素和兒茶素的產量，在搖瓶水平上產量分別為64mg/l、41mg/L，經過5L發酵罐的優化，最終可使阿福豆素與兒茶素的產量分別達到500.5mg/L、321.3mg/L。

技術領域

本發明涉及合成阿福豆素和兒茶素的釀酒酵母菌株及其應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

黃烷-3-醇類((Flavan-3-ols))物質是植物中天然存在的一類具有生物活性的植物化學物質，已被報道顯示出多種有益健康的作用，可作為抗氧化抗癌藥物、保護心血管健康、參與糖尿病的預防控制。阿福豆素((+)-afzelechin，AFZ)和兒茶素((+)-catechin，CAT)同為黃酮化合物中的黃烷3-醇類物質，一般從植物中提取獲得。在各類黃酮類化合物中，兒茶素是最有效的自由基清除劑，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌活性，可清除因氧化損傷而產生的活性氧，作為活性氧的有效清除劑，有助于防止衰老和其他因氧化損傷而發生的疾病，此外，有動物實驗研究表明兒茶素可以減少腸道腫瘤的數量。阿福豆素可以調節胰腺細胞胰島素分泌，促進胰島素的分泌，從而改善2型糖尿病；還可以作為抗氧化劑維持心臟健康。近年來，陸續有研究在大腸桿菌或者釀酒酵母中合成黃烷-3醇類化合物，選用安全模式微生物釀酒酵母作為宿主，能夠在很大程度上保證產物的安全性。

黃烷-3-醇類物質的生物合成主要由莽草酸途徑、苯丙烷途徑、類黃酮合成途徑組成。在莽草酸途徑中，戊糖磷酸途徑產生的4-磷酸赤蘚糖((E4P))和糖酵解途徑產生的磷酸烯醇式丙酮酸((PEP))在3-脫氧-D-7-磷酸阿拉伯庚酮糖酸合成酶(DAHPS)作用下合成3-脫氧-D-7-磷酸阿拉伯庚酮糖酸(DAHP)，接著在其他酶作用下連續反應得到芳基氨基酸、維生素、木質素、酚類物質、生物堿等；其中，苯丙氨酸或酪氨酸分別在在苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酪氨酸解氨酶(TAL)作用下得到肉桂酸或對香豆酸，肉桂酸在依賴細胞色素P450的4-肉桂酸羥化酶(C4H)作用下轉化為對香豆酸，然后在香豆酸CoA連接酶(4CL)作用下得到對香豆酰CoA，1分子對香豆酰CoA與3分子丙二酰CoA在查耳酮合成酶(CHS)作用下合成柚皮素查耳酮，并在查耳酮異構酶(CHI)作用下環化得到柚皮素。柚皮素在類黃酮3’羥化酶(F3’H)、類黃酮3’，5’羥化酶(F3’5’H)作用下分別在B環引入了一個和兩個羥基得到黃烷酮，隨后被黃烷酮3-羥化酶(F3H)催化得到二氫黃酮醇類(DHF)化合物，然后被二氫黃烷醇4-還原酶(DFR)催化還原合成無色花青素。無色花青素可被還原酶(LAR)直接還原得到兒茶素。另外，柚皮素也直接在類黃酮3羥化酶(F3H)作用下在C環引入一個羥基得到二氫黃酮醇類化合物-二氫山奈酚(DHK)，然后在DFR、LAR催化下得到黃烷-3醇類化合物-阿福豆素(圖1)。現有技術中有文獻記載了對釀酒酵母進行基因工程改造生成阿福豆素和兒茶素的方案，但仍存在產量較低的問題，主要原因在于DFR和LAR的催化效率低，中間產物的不穩定也可能是造成終產物產量低的原因，此外，NADPH的供給不足也可能限制了產量的生成。

發明內容