[發(fā)明專利]用于檢測4種鮑特菌和特異性檢測百日咳鮑特菌的DNA片段、引物、探針和試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111101620.0
• 申請日: 2021-09-18
• 公開（公告）號: CN113718045B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李春明;趙百慧;湯志強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 上海伯杰醫(yī)療科技股份有限公司北京分公司;上海伯杰醫(yī)療科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 上海碩力知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31251
• 代理人: 王法男

本發(fā)明涉及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測4種鮑特菌和特異性檢測百日咳鮑特菌的DNA片段、引物、探針和試劑盒及應(yīng)用。本發(fā)明提供用于百日咳鮑特菌、副百日咳鮑特菌、霍氏鮑特菌和支氣管敗血鮑特菌檢測的DNA片段和特異性引物，能夠?qū)崿F(xiàn)對4種鮑特菌的測序分型檢測，具有較高的特異性和準(zhǔn)確性。本發(fā)明還提供用于特異性檢測百日咳鮑特菌的引物探針組，能夠利用多重?zé)晒釶CR法特異性檢測百日咳鮑特菌，具有較高的靈敏度、特異性和重復(fù)性，為鮑特菌的檢測提供了有效的工具和方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測4種鮑特菌和特異性檢測百日咳鮑特菌的DNA片段、引物、探針和試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

百日咳鮑特菌(Bordetella pertussis，BP)為鮑特菌屬(Bordetella)細(xì)菌，是一種革蘭氏陰性小桿菌，是人類百日咳的病原菌，該細(xì)菌主要通過空氣傳播，具有高度傳染性且人為唯一的宿主，能夠引起急性呼吸道傳染病，人群普遍易感，其中多見于嬰幼兒和年齡小的兒童，是嚴(yán)重威脅人類健康的主要傳染病之一。該細(xì)菌感染的臨床表現(xiàn)為陣發(fā)性痙攣咳嗽、嘔吐、病程通常持續(xù)數(shù)周，嬰兒易并發(fā)肺炎、癲癇，從而導(dǎo)致死亡。百日咳鮑特菌感染的及時確診，做到早發(fā)現(xiàn)早治療對于病情控制和愈后十分重要，若要實現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)早治療，百日咳鮑特菌感染的早期診斷極為重要。

目前，百日咳鮑特菌的檢測方法主要分為以下3種：

1、細(xì)菌分離培養(yǎng)法：主要分為兩種，一種是咳碟法，另一種是鼻咽拭子培養(yǎng)法。咳碟法在病程早期，無劇烈咳嗽或年齡較小的嬰兒不易獲得成功。目前認(rèn)為鼻咽拭培養(yǎng)法優(yōu)于咳碟法，培養(yǎng)越早陽性率越高，在卡他期培養(yǎng)可達(dá)90％，發(fā)病第3～4周陽性率僅有50％，在陣咳時或陣咳后采樣陽性率較高。該方法雖然特異性好，但敏感性受取標(biāo)本前應(yīng)用抗生素、取標(biāo)本時發(fā)病時間長、疫苗接種等影響，培養(yǎng)需3～7天才能出結(jié)果，耗費周期比較長，不利于疑似患者的快速診斷和治療，因此不利于臨床的早期診斷。

2.血清學(xué)檢測：血清學(xué)檢測方法較多，分為以下幾種：

(1)ELISA：目前多采用百日咳鮑特菌毒素和絲狀血凝素作為抗原來檢測百日咳特異性IgM抗體，陽性率達(dá)70％。該方法特異性高、快速經(jīng)濟(jì)，是目前診斷百日咳鮑特菌感染的可靠方法之一，但靈敏度低，且百日咳鮑特菌培養(yǎng)難度高，容易出現(xiàn)假陰性。

(2)蛋白印跡法：采用抗百日咳毒素單克隆抗體進(jìn)行酶聯(lián)斑點蛋白印跡法檢測百日咳患者鼻咽分泌物中百日咳毒素，特異性高，但操作步驟復(fù)雜繁瑣。

(3)單克隆抗體菌落印跡法：采用抗百日咳鮑特菌脂多糖和絲狀血凝素單克隆抗體菌落印記ELISA來檢測百日咳鮑特菌，48h可在硝化纖維膜上出現(xiàn)清晰藍(lán)色斑點陽性印跡反應(yīng)，此方法試驗周期長，檢測費力耗時，不便于大規(guī)模檢測和推廣。

(4)熒光抗體法：應(yīng)用鼻咽拭分泌物涂片，加上吸附熒光的高價百日咳抗血清，30min后在熒光顯微鏡下觀察病原菌，適用于快速診斷，早期患者75％～80％陽性。但檢測結(jié)果存在假陽性，所以不能代替培養(yǎng)法。

總體而言，血清學(xué)檢測對病程10天左右的人群檢測陽性率高，但取樣周期比較長，因此應(yīng)用于早期診斷相對來說比較困難，且一些具有免疫缺陷、免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善的患兒不能對病原體產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答。百日咳的免疫學(xué)檢測方法常取疑似急性期與恢復(fù)期2份血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，取樣周期比較長，且靈敏度和特異性都不高，不適用百日咳的快速診斷。

3、分子生物學(xué)檢測：PCR是目前直接病原體檢測的首選方法，這些技術(shù)包括實時PCR、巢式PCR、多重PCR等。此外，還有等溫擴(kuò)增技術(shù)，包括SAT、LAMP等。PCR方法具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等特點，大大地提高了檢測效率。