[發(fā)明專利]靶向小鼠BBS５基因的gRNA及構(gòu)建Bardet–Biedl小鼠模型的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111097311.0
• 申請(qǐng)日: 2021-09-18
• 公開（公告）號(hào): CN113862266A
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孔珊珊;趙鑫巖;吉曉洋;王丁力
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N9/22;C12N15/89;C12N15/12;A01K67/027;C12Q1/6888
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32267
• 代理人: 石磊

1.一組靶向小鼠BBS５基因的gRNA，其特征在于，包括兩條gRNA，其核酸序列分別為：

gRNA1=SEQ ID NO 1=5’- ACTCTTACTATCCTATCCACTGG-3’；

gRNA2= SEQ ID NO 2= 5’ -TTCAATCCCCATGACGCTCATGG-3’。

2.一種靶向小鼠BBS５基因的基因敲除試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括如權(quán)利要求1中的一組靶向小鼠BBS５基因的gRNA。

3.使用如權(quán)利要求1所述的一組靶向小鼠BBS５基因的gRNA構(gòu)建Bardet–Biedl 綜合癥小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括利用gRNA1和gRNA2將小鼠BBS５基因敲除。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述gRNA1和gRNA2分別靶向BBS５基因第３個(gè)外顯子的５＇端和第７個(gè)外顯子的３＇端。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述gRNA1和gRNA2將BBS５基因第３～第７個(gè)外顯子之間的６０９２ｂｐ的DNA切除，切除后的基因在轉(zhuǎn)錄形成的mRNA第２個(gè)外顯子與第８?jìng)€(gè)外顯子剪切時(shí)融合，翻譯蛋白質(zhì)時(shí)形成移碼突變。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）將上述兩條gRNA與Cas9蛋白共注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠體內(nèi)，產(chǎn)出小鼠，即為F0小鼠；

2）提取F0代小鼠尾部DNA，PCR擴(kuò)增并將產(chǎn)物送測(cè)序，鑒定是否為嵌合體；3）待雄性Founder小鼠到8周齡，雌性小鼠到6周齡，分別與野生型異性小鼠交配獲得F1代雜合子小鼠，小鼠出生14天后PCR鑒定，若有陽性小鼠出生，則表示基因敲除成功。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟1中的測(cè)序引物為：

PCR測(cè)序引物=SEQ ID NO 3=5’-GCCTTCATTGCTCTAGTGTTAGGA-3。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟3中PCR鑒定中的引物包括：

PCR Primers1，其序列分別為：

F1=SEQ ID NO 4=5’-AGAGCCAGATACGGTAGTGCATGCT-3’

R1= SEQ ID NO 5=5’-GCCTTCATTGCTCTAGTGTTAGGA-3’。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟3中PCR鑒定中的引物包括：

PCR Primers2，其序列分別為：

F1=SEQ ID NO 4=5’-AGAGCCAGATACGGTAGTGCATGCT-3’

R2=SEQ ID NO 6=5’-ACAAGAGCCAGAGGTCCTGGG-3’。

10.如權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)所述的方法構(gòu)建獲得的Bardet–Biedl 綜合癥模型小鼠。