[發明專利]一種適用于產孢真菌快速鑒定植物病原菌種類的方法

在審

• 申請號: 202111095911.3
• 申請日: 2021-09-18
• 公開（公告）號: CN113637734A
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 伏榮桃;盧代華;陳誠;王劍;向運佳;趙黎宇;陳雪娟
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6895;C12Q1/04
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 劉磊

1.一種適用于產孢真菌快速鑒定植物病原菌種類的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.樣本收集與處理：從發病植物上采集新鮮病害癥狀典型且帶有產孢病原物的樣本，然后從采集的樣本中選取帶有產孢病原物樣本進行殺菌；

S2.病原菌孢子收集：使用步驟S1中產孢病原物樣本制備孢子懸浮液，所述孢子懸浮液作為后續PCR反應中的DNA模板；

S3.PCR反應：采用真菌通用引物ITS4和ITS5對步驟S2中的孢子懸浮液進行PCR擴增，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增產物片段大小；

S4.測序分析確定病原菌種類：將步驟S3中目的片段進行測序，得到的DNA序列在NCBI上進行Blast對比，從而確定導致植物真菌病害的病原菌種類。

2.根據權利要求1所述的一種適用于產孢真菌快速鑒定植物病原菌種類的方法，其特征在于，所述步驟S1中新鮮病害癥狀典型且帶有產孢病原物的樣本為：霉狀物、霜霉狀物、粉狀物、球狀物、銹狀物、棉絮狀物、絮狀物、絲狀物、顆粒狀物或點狀物。

3.根據權利要求1所述的一種適用于產孢真菌快速鑒定植物病原菌種類的方法，其特征在于，所述步驟S1中新鮮病害癥狀典型且帶有產孢病原物的樣本采集后于4℃保存，備用。

4.根據權利要求1所述的一種適用于產孢真菌快速鑒定植物病原菌種類的方法，其特征在于，所述步驟S1中殺菌為使用紫外燈殺菌20-30min。

5.根據權利要求1所述的一種適用于產孢真菌快速鑒定植物病原菌種類的方法，其特征在于，步驟S2中孢子懸浮液制備方法為，用無菌解剖針挑起樣本表面的孢子于EP管中，加入50-100ml無菌水，在振蕩器上震蕩3-5min。

6.根據權利要求5所述的一種適用于產孢真菌快速鑒定植物病原菌種類的方法，其特征在于，所述EP管為1.5ml EP管。

7.根據權利要求1所述的一種適用于產孢真菌快速鑒定植物病原菌種類的方法，其特征在于，所述步驟S3中PCR擴增體系為：ITS4引物和ITS5引物各2.5ul、孢子懸浮液5-6ul、2×Taq Master Mix 25ul，再用ddH₂O補足到50ul。

8.根據權利要求1所述的一種適用于產孢真菌快速鑒定植物病原菌種類的方法，其特征在于，所述步驟S3中PCR擴增條件為：96-97℃預變性6-8min，96-97℃變性40-50s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35-40個循環；72℃終延伸5-8min。

9.根據權利要求1所述的一種適用于產孢真菌快速鑒定植物病原菌種類的方法，其特征在于，所述步驟S4中的測序結果對比確定病原菌種類的方法為：將測序結果在NCBI上進行Blast對比，匹配長度最長，序列相似率達99％-100％的真菌被判定為被鑒定植物病原菌所屬真菌。