[發(fā)明專利]一種用于快速檢測草莓皺縮病毒的特異性核酸序列及其擴增引物、試劑盒及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111095800.2
• 申請日: 2021-09-18
• 公開（公告）號: CN113637805A
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄒小花;倪一多;高清華;段可
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 南京華恒專利代理事務所(普通合伙) 32335
• 代理人: 裴素艷

本發(fā)明公開一種用于快速檢測草莓皺縮病毒（SCV）的特異性核酸序列及其擴增引物、試劑盒及方法。本發(fā)明基于草莓皺縮病毒基因組設(shè)計草莓皺縮病毒基因組特異性保守序列，同時設(shè)計了特異性專用引物。本發(fā)明通過篩選草莓皺縮病毒特異保守引物和探針，基于逆轉(zhuǎn)錄?重組酶聚合酶恒溫擴增（RT?nfo?RPA）方法，優(yōu)化恒溫擴增條件，結(jié)合試紙條將擴增產(chǎn)物結(jié)果可視化，在探索草莓樣本核酸RNA現(xiàn)場快提的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)草莓皺縮病毒SCV簡單、快速、高靈敏檢測，并將檢測所需試劑和器材組裝成易于攜帶和可供現(xiàn)場使用的試劑盒，適用于草莓種苗繁育、脫毒培養(yǎng)、田間調(diào)查時草莓皺縮病毒SCV快速檢測和生產(chǎn)應用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于草莓皺縮病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于快速檢測草莓皺縮病毒的特異性核酸序列及其擴增引物、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

草莓(Fragaria×ananassa)為薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)宿根性多年生草本植物。草莓病毒病在世界各地分布廣泛，削弱植株生長勢，降低產(chǎn)量和品質(zhì)，危害草莓生產(chǎn)。目前已報道的可浸染草莓的病毒有20多種，其中草莓皺縮病毒(Strawberrycrinkle virus,SCV)是危害草莓較為嚴重的一種病毒，也是危害草莓生產(chǎn)的4種主要病毒之一。

由于草莓種苗通過匍匐莖營養(yǎng)繁殖而來，一旦母株帶毒，繁殖的后代均帶毒。植物病毒病害一旦發(fā)生難以控制，造成植株的長勢減弱，從而增加了其他病害的浸染幾率，若從根本上解決病毒病的危害，需提前對草莓組培苗和種苗圃草莓進行病毒病的檢測篩選，后及時清除攜帶病毒種苗，從而可保證在生產(chǎn)中使用無毒種苗栽培。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，草莓皺縮病毒(SCV)分離、PCR檢測、實時熒光定量PCR檢測、特異性片段克隆、序列分析等方面有一些的研究進展。

重組酶聚合酶恒溫擴增(Recombinase polymerase amplification，簡稱RPA)是一種由重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換Bsu聚合酶參與的恒溫擴增新技術(shù)，可在23-45℃下連續(xù)進行反應，反應時間只需5-20min，特異性強，靈敏度高，非常適用于現(xiàn)場檢測和疾病控制。RPA技術(shù)在核酸特異性擴增和檢測領(lǐng)域已經(jīng)顯示出強大的威力，具有取代PCR擴增和檢測的趨勢，但該技術(shù)在草莓領(lǐng)域的應用研究較少。

逆轉(zhuǎn)錄-重組酶聚合酶恒溫擴增(Reverse transcription-Recombinasepolymerase amplification，簡稱RT-RPA)技術(shù)，該檢測技術(shù)的第一步是將病毒RNA片段逆轉(zhuǎn)錄為cDNA以便于后續(xù)核酸擴增；接下來用RPA恒溫擴增的方式，搭配合適探針，進而實現(xiàn)對cDNA的指數(shù)擴增以及對擴增后的核酸產(chǎn)物的檢測。檢測結(jié)果既可以通過觀察熒光，瓊脂糖凝膠電泳，也可以用更為簡便的試紙條方式呈現(xiàn)出來。

但是，目前對于草莓皺縮病毒的檢測，并沒有上述相關(guān)技術(shù)有效的應用。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明的第一個目的是提供一種用于快速檢測草莓皺縮病毒的特異性核酸序列。

本發(fā)明的第二個目的在于提出一種用于快速檢測草莓皺縮病毒的專用引物，其特異性強，靈敏度高。

本發(fā)明第三個目的是提供一種包括上述引物的試劑盒，并且其中還包括探針。

本發(fā)明第四個目的是提供一種利用上述引物或試劑盒快速檢測草莓皺縮病毒的方法，其操作簡單、耗時短、靈敏度高。

技術(shù)方案：為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種用于快速檢測草莓皺縮病毒的特異性核酸序列，所述基因序列如SEQ IDNO.11所示。

本發(fā)明用于擴增上述的特異性基因序列的專用引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物；

所述正向引物的核苷酸序列選自如下序列中的一種：