[發明專利]BmSPI38的同型串聯多聚體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202111087455.8
• 申請日: 2021-09-16
• 公開（公告）號: CN113789341B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 李游山;楊璽
• 申請（專利權）人: 陜西理工大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K19/00;C07K1/22;A61K38/57;A61P31/10;C12R1/19
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

1.BmSPI38的同型串聯多聚體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1，設計并合成串聯多聚體引物BmSPI38-Nde I-BamH I-F、BmSPI38-Not I-R、BmSPI38-Bgl II-R和BmSPI38-L-Bgl II-R，以BmSPI38-p28為模板擴增獲得目的基因片段，回收目的片段后與T載體連接，然后轉入感受態細胞，培養后篩選陽性克隆，分別記為，NdeI/BamH I-SPI38-Not I、NdeI/BamHI-SPI38-Bgl Ⅱ、NdeI/BamHI-SPI38L-Bgl Ⅱ；

所述引物BmSPI38-Nde I-BamH I-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述引物BmSPI38-Not I-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述引物BmSPI38-Bgl II-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述引物BmSPI38-L-Bgl II-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

S2，利用Nde I和Not I雙酶切，將Nde I/BamH I-SPI38-Not I從T載體上切下，連接到p28載體上，成功構建BmSPI38單體的表達載體BmSPI38-monomer；

S3，同尾酶法設計并構建了BmSPI38同型串聯多聚體的表達載體；

所述BmSPI38同型串聯多聚體的表達載體為：

不加Linker的BmSPI38二聚體載體BmSPI38-dimer，加Linker的BmSPI38二聚體載體BmSPI38-L-dimer，不加Linker的BmSPI38三聚體載體BmSPI38-trimer，加Linker的BmSPI38三聚體載體BmSPI38-L-trimer，不加Linker的BmSPI38四聚體載體BmSPI38-tetramer，加Linker的BmSPI38四聚體載體BmSPI38-L-tetramer；

S4，將獲得的BmSPI38單體的表達載體和BmSPI38同型串聯多聚體的表達載體轉入大腸桿菌中，并利用IPTG對其進行誘導表達，然后通過離心收集菌體，超聲破碎菌體細胞，離心獲得表達有BmSPI38單體蛋白和BmSPI38同型串聯多聚體蛋白的菌體上清，然后進行蛋白純化，所述蛋白純化方式為鎳柱親和層析純化，用400mM咪唑洗脫；

相比于BmSPI38單體，BmSPI38串聯多聚體對蛋白酶的抑制活性能力強，均一性好。