[發明專利]BmSPI39的同型串聯多聚體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202111086491.2
• 申請日: 2021-09-16
• 公開（公告）號: CN113788898B
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 李游山;楊璽
• 申請（專利權）人: 陜西理工大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/55;A61P31/10;C12R1/19
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明涉及多聚體構建技術領域，具體公開了BmSPI39的同型串聯多聚體及其構建方法和應用，通過設計并合成串聯多聚體引物BmSPI39?Nde I?BamH I?F、BmSPI39?Not I?R、BmSPI39?Bgl II?R和BmSPI39?L?Bgl II?R，以BmSPI39?p28為模板擴增獲得目的基因片段，利用同尾酶法設計并構建了BmSPI39同型串聯多聚體載體，再通過轉化、誘導表達、純化獲得BmSPI39同型串聯多聚體。本發明獲得的BmSPI39同型串聯多聚體能夠成功抑制枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K的活性，且活性更強，表達形式更為均一。

技術領域

本發明涉及多聚體構建技術領域，具體涉及BmSPI39的同型串聯多聚體及其構建方法和應用。

背景技術

家蠶(又稱桑蠶)是一種絹絲昆蟲，屬鱗翅目蠶蛾科，具有非常高的經濟價值。研究發現，昆蟲體內的免疫過程缺乏淋巴細胞及免疫球蛋白的參與，病原微生物在入侵其宿主的過程中會分泌大量的胞外蛋白酶，這些胞外蛋白酶可作為毒力因子來輔助病原微生物對昆蟲的入侵過程。為了抵御病原微生物的入侵，宿主生物在一般情況下都會表達高水平的蛋白酶抑制劑，以抵抗病原微生物所分泌的胞外蛋白酶。因此絲氨酸蛋白酶抑制劑在昆蟲的免疫系統中占據非常重要的作用。

從家蠶中共鑒定到了80種絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor，SPI)，其中包括11種SPI結構域的蛋白酶抑制劑，即Serpin、Kunitz、BPTI、Kazal、TIL等。BmSPI39屬于TIL類蛋白酶抑制劑，可通過抑制球孢白僵菌分泌的體壁降解蛋白酶CDEP-1來防止真菌菌絲穿透家蠶體壁，因此可作為家蠶真菌抗性因子發揮重要的免疫功能。但是研究發現BmSPI39單體形式無抑制活性，且發現BmSPI39多聚體形式雖然具有對枯草桿菌蛋白酶和蛋白酶K的抑制活性，但是目前多聚體化對蛋白酶抑制劑自身活性的影響尚不完全清楚。且發現，現有技術中BmSPI39多聚體活性低、均一性差。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了BmSPI39的同型串聯多聚體及其構建方法和應用，利用同尾酶法設計并構建了BmSPI39同型串聯多聚體的表達載體，再通過轉化、誘導表達、純化獲得BmSPI39同型串聯多聚體，能夠成功抑制枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K的活性，且活性更強，表達形式更為均一。

本發明的第一個目的是提供BmSPI39的同型串聯多聚體的構建方法，具體包括如下步驟：

S1，設計并合成串聯多聚體引物BmSPI39-Nde I-BamH I-F、BmSPI39-Not I-R、BmSPI39-Bgl II-R和BmSPI39-L-Bgl II-R，以BmSPI39-p28為模板擴增獲得目的基因片段，回收目的片段后與T載體連接，然后轉入感受態細胞，培養后篩選陽性克隆，分別記為，NdeⅠ/BamHⅠ-SPI39-NotⅠ、Nde I/BamH I-SPI39-BglⅡ、Nde I/BamH I-SPI39L-BglⅡ；

所述引物BmSPI39-Nde I-BamH I-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述引物BmSPI39-Not I-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述引物BmSPI39-Bgl II-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述引物BmSPI39-L-Bgl II-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

S2，利用Nde I和Not I雙酶切，將Nde I/BamH I-SPI39-Not I從T載體上切下，連接到p28載體上，成功構建BmSPI39單體的表達載體BmSPI39-monomer；

S3，同尾酶法(BamH I與BglⅡ互為同尾酶)設計并構建了BmSPI39同型串聯多聚體的表達載體；