[發明專利]一種通過基因編輯提高水稻抗病性的方法及其應用

有效

• 申請號: 202111083039.0
• 申請日: 2021-09-15
• 公開（公告）號: CN114164228B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發明（設計）人: 張海文;肖桂青;嚴圣杰;陳雅婷;張執金
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所;湖南農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/113;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所(普通合伙) 11039
• 代理人: 劉江良

本發明公開了一種培育抗稻瘟病水稻品種的方法：通過基因工程方法將水稻植株中的OsWRKY70基因功能失活，以獲得對稻瘟病抗性提高的水稻材料。利用本發明方法可對水稻稻瘟病的抗性進行遺傳改良，但不影響水稻的正常生長發育。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種通過基因編輯提高水稻抗病性的方法及其應用。

背景技術

稻瘟病是世界各稻區最具危害性的水稻病害之一，嚴重影響稻米品質與產量，威脅世界糧食安全，是阻礙水稻優質、高產、穩產和保收的最主要因素之一。稻瘟病由絲狀子囊真菌稻瘟病菌引起，具有流行速度極快等特點，在各個稻區經常發生，主要為害葉片、莖稈、穗部。稻瘟病所造成的產量損失一般為10％～20％，嚴重發病時可達到40％～50％，甚至顆粒無收。如2014年，我國稻瘟病危害面積達513.6萬公頃，造成減產55.8萬噸。由于稻瘟病菌小種的遺傳復雜性與易變性，培育抗病與豐產、優質能相結合優良品種是水稻育種中長期艱巨的課題。目前，稻瘟病的防治主要通過化學農藥防控，但該方法成本高、費時耗力，且嚴重危害生態環境和人類健康。實踐證明，培育和種植抗病品種是控制稻瘟病最為經濟、安全和有效的方法。傳統育種耗時長、工作量大，且難以定向改良目標性狀，隨著功能基因組學和分子輔助設計育種技術研究的不斷深入，常規抗病育種與生物技術相結合是高效、精準、快速培育抗病新品種的有效途徑。

CRISPR-Cas9技術是設計一段sgRNA介導Cas9核酸酶對靶標位點進行特異性識別和靶向切割，并利用胞內易錯修復機制引入突變。該技術操作簡單、突變效率高、周期短、費用低，可以得到不含標記基因的種質資源，對種質資源創新和基因功能研究有重大意義。目前該技術精確地對水稻、玉米、小麥、高粱、番茄、馬鈴薯等農作物的基因組進行特異位點的修飾，能快速、準確、有效地定向改良品種性狀，在改良農作物的特異基因表達、代謝調控、抗病蟲害、脅迫反應、營養利用、產量與品質等性狀中成功應用，為農作物品種改良提供了新的思路。

水稻基因組有許多WRKY轉錄因子參與了水稻免疫反應，如WRKY45正調控水稻對稻瘟病和白葉枯病的抗性，WRKY62和WRKY76負調控水稻的免疫反應。已有研究表明OsWRKY70的表達受機械損傷以及蟲害二化螟取食和褐飛虱取食的誘導，是一個蟲害誘導防御網絡中的關鍵節點。OsWRKY70正調控茉莉酸和胰蛋白酶抑制劑合成及水稻對二化螟的抗性，而負調控赤霉素、水楊酸、過氧化氫合成及水稻對褐飛虱的抗性。

發明內容

我們對日本晴水稻 OsWRKY70基因進行編輯，對基因編輯水稻株系進行DNA測序分析，與 OsWRKY70基因序列相比，發現基因編輯株系CRS6，8和9株系在 OsWRKY70編碼區的347位插入一個A，CRS7株系在347位插入一個T（圖2），該位點一個堿基的插入導致基因編輯株系中OsWRKY70蛋白在116位發生移碼，并且在177位氨基酸處提前終止蛋白編碼，導致這些水稻株系中OsWRKY70蛋白的功能缺失(圖3)。我們對基因編輯水稻田間的全生育期農藝性狀觀察，發現該基因編輯不影響水稻的正常生長發育和農藝性狀；對基因編輯水稻材料CRS7和CRS9進行抗病性分析，二葉一心期噴霧接種稻瘟病菌小種R01-1，發現其葉片上病斑數目明顯少于野生型葉片上病斑，表明OsWRKY70基因編輯能提高水稻對稻瘟病的抗性。

本發明提供的技術方案是：一種培育抗稻瘟病水稻品種的方法，通過基因工程方法將水稻植株中的OsWRKY70基因功能失活，以獲得對稻瘟病抗性提高的水稻材料。

上述的方法，所述基因工程方法選自物理或化學誘變、同源重組、基因編輯。

上述的方法，所述基因編輯是CRISPR-Cas9基因編輯方法。

上述的方法，所述OsWRKY70基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。