[發明專利]一種改造的人源糖基轉移酶、制備方法及應用

在審

• 申請號: 202111071570.6
• 申請日: 2021-09-14
• 公開（公告）號: CN113621594A
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 蘇延停;楊秀怡;鄧夢雪;李準潔;祝賀;劉武
• 申請（專利權）人: 湖北科技學院
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12Q1/48
• 代理公司: 咸寧鴻信專利代理事務所(普通合伙) 42249
• 代理人: 劉喜

本發明公開了一種改造的人源糖基轉移酶、制備方法及應用。屬于生物技術領域。通過去除人源C1GALT1的轉移酶膜結合結構域,得到改造蛋白C1GalT1?1。糖結合實驗顯示，原核表達的C1GalT1?1突變體保持了結合O?GalNAc類型修飾，對其他糖基化修飾并不結合。單糖封閉實驗顯示，經過GalNAc單糖孵育后，C1GalT1的活性完全被抑制，因此本發明改造蛋白在識別和大規模鑒定O?GalNAc糖基化修飾具有更大的應用潛力。

技術領域

本發明屬于生物科技技術領域，涉及一種改造的人源糖基轉移酶、制備方法及應用。

背景技術

糖基轉移酶是廣泛存在于內質網和高爾基體內的一大類酶類，參與體內重要的活性物質如糖蛋白和糖脂中糖鏈的合成。其作用是把相應的活性供體(通常是二磷酸核苷NDP-糖)的單糖部分轉移至糖、蛋白質、脂類和核酸等，完成后者的糖基化加工實現其生物學功能。目前已經發現了超過上百種糖基轉移酶，合成了超過7000種復雜的糖結構，細胞內大部分蛋白都會被糖基化修飾，現在已經發現糖基化修飾參與各種生物過程，調控基本生理活動。

O-GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)修飾是大多數O-連接糖基化修飾(除去O-GlcNAc(N-乙酰葡萄糖胺)修飾)的第一步修飾，主要發生在高爾基體內，有20多種糖基轉移酶可以完成這一步，通過糖基轉移酶ppGalNAc-Ts將底物UDP-GalNAc共價連接到蛋白的絲氨酸或蘇氨酸上，首次發現于1969年。正常生理情況下，O-連接糖基化一般會繼續延伸，通過半乳糖糖基轉移酶C1GalT1在GalNAc單糖后面添加一個半乳糖。但是C1GalT1并不能單獨完成加糖過程，必須其專門的分子伴侶Cosmc幫助下可以在O-GalNAc修飾后面轉移一個半乳糖。O-GalNAc修飾之前一直被認為合成起始于高爾基體中，大部分分泌到細胞外，有部分存在于腫瘤細胞的表面，特別是一些mucin類型的糖蛋。但是最近有文章報道，在細胞核中同樣發現了大量的O-GalNAc修飾的信號，并且在細胞核中成功鑒定到了ppGalNAc-T3糖基轉移酶。

傳統的觀點認為O-GalNAc修飾主要發生分泌途徑中，主要修飾的靶蛋白為分泌蛋白和膜蛋白。因此O-GalNAc修飾的功能研究目前主要集中膜蛋白和一些體液例如血清中的糖蛋白的功能，因為和腫瘤密切相關，O-GalNAc修飾也叫腫瘤相關抗原即Tn抗原。目前已經有幾種Tn抗原陽性的糖蛋白例如黏蛋白CA15-3(MUC1)和CA125(MUC16)在臨床上已經用于多種惡性腫瘤的診斷和預后跟蹤，例如肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和卵巢癌等，Tn抗原表達的上升一般預示著腫瘤惡性程度的增加和預后不良。在乳腺癌中，高表達的Tn抗原可以通過招募Galectin-3和MUC1使腫瘤細胞能夠吸附在內皮細胞上，從而促進了腫瘤細胞的轉移。然而Tn抗原在腫瘤發展中到底扮演著什么樣的角色，目前仍然不是很清楚。

目前已經有很多工具用于去識別O-GalNAc修飾，其中凝集素仍然是廣泛用于檢測和結合O-GalNAc修飾的工具，例如凝集素VVL、TL2、MPL、DBA和Ricin等，這些凝集素大多來源于植物和真菌。這些報道識別O-GalNAc修飾的凝集素都是由二聚體或者四聚體通過非共價連接，特異性不專一，會結合其他的單糖例如galactose末端糖結構。綜合而言，目前并沒有一個對O-GalNAc修飾十分特異的凝集素，識別工具的缺乏也導致了對O-GalNAc修飾的研究十分困難。

除了凝集素外，有課題組發現糖加工的酶也有結合糖蛋白的能力，通過敲除酶的催化活性位點，讓其保留對糖結合的能力，從而用于去識別糖基化修飾。例如有文章對來源于細菌的O-GlcNAc糖苷水解酶CpOGA進行改造，突變了其催化活性位點，結果顯示改造后的CpOGA失去了切除O-GlcNAc修飾的活性，但是保留了結合O-GlcNAc修飾的糖結合活性，改造后的CpOGA已經在很多復雜樣品對O-GlcNAc修飾都有很好的富集效果。鑒于CpOGA改造的成功，為了研發識別O-GalNAc修飾的識別工具，很有必要對O-GlcNAc修飾延伸的糖基轉移酶C1GalT1進行改造，從而篩選出對O-GalNAc修飾的特異性結合的工具，推動O-GalNAc修飾的功能研究。

發明內容