[發明專利]一種用于制備二氫槲皮素的黃酮還原酶

有效

• 申請號: 202111060438.5
• 申請日: 2021-09-10
• 公開（公告）號: CN113755460B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 范文超;劉映淼;高書良;施鑫磊
• 申請（專利權）人: 浙江華睿生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 賈師英

本發明公開了一種黃酮還原酶SEQ?ID?NO:1，其能夠催化槲皮素發生還原反應來制備二氫槲皮素，具有研究開發應用潛力。

技術領域

本發明屬于酶催化領域，具體地說，涉及一種黃酮還原酶及其在制備二氫槲皮素中的用途。

背景技術

二氫槲皮素是從落葉松、花旗松等松科植物中提取出來的一種天然活性物質，屬于生物黃酮類擬維生素P，學名二氫槲皮素，英文名有Dihydroquercetin、Taxifolin等，分子式為C15H12O7，分子量304.25，具有重要的抗酪氨酸酶活性、抗纖維化、抗氧化能力和膠原酶活性抑制能力等。

目前二氫槲皮素主要的制備方法有植物提取法和發酵法，尚未見酶催化方法的報道。2020年，江南大學高松等在《生物工程學報》報道了來源于水飛薊轉錄組中鑒定得到一個黃酮3-羥化酶SmF3H(Flavone?3-hydroxylase，F3H)，組合SmF3’H(Flavone?3’-hydroxylase，F3’H)和cytochrome?P450?reductases(CPR)，以柚皮素為底物制備二氫槲皮素，在搖瓶中產量達到695.90mg/L；在5-L發酵罐上以柚皮素為底物發酵得到3.54g/L二氫槲皮素。同年，江南大學李廣建等在“Journal?of?Agricultural?and?Food?Chemistry”中報道了以葡萄糖或者柚皮素制備二氫楊梅素，通過多拷貝整合可以獲得菌株以2.5g/Lnaringenin為底物可產709.6mg/L二氫楊梅素和670.68mg/L二氫槲皮素，以葡萄糖為底物可產246.4mg/L二氫楊梅素和114.1mg/L二氫槲皮素。

發明內容

2021年，中國科學院分子植物科學卓越創新中心楊高華等在naturecommunication上報道了一種來源于腸道菌的Flavonifractor?plautii?ATCC?49531的新型黃酮還原酶(flavone?reductase，FLR)(NCBI：WP_009257602.1)，在嚴格厭氧條件下可以還原黃酮或黃酮醇生成二氫黃酮和二氫黃酮醇。受此啟發，我們嘗試使用該酶用于還原槲皮素來制備二氫槲皮素，但在有氧條件下，未能合成出二氫槲皮素。作為一種嘗試方案，我們考慮對此酶進行定向進化，探索在有氧條件下催化槲皮素還原的可能性，并意外地取得了突破，奠定了本發明及后續改進的基礎。

因此，本發明的第一個方面提供了一種多肽，所述的多肽選自下組：

(a)具有SEQ?ID?NO:1氨基酸序列的多肽：

MKILGISGGMRNGSNDGMCIEALMGAKEMGAEVEFIQLQNLHIEHCTGCTACVQSVLGGRGGKCVLKDDFDWLLDKMLDADGIVFSTPIFKKGATGLFHTITDRFGPRMDRGNNIIGTKIAEETSGTAPDPRILKDKVISFMSVGGSDWVTRTQCDAGMLALTPMWKVIDNEVFPWALSILVEDERVARAHQIGRTIAEAAKDIEHAQYQGDAGVCPHCHSRNFHLQDGKAICCLCGLEGEIHNEGGKYSFTFPAEQLEHAHDTLSGKFIHGNDIKENTGKKIANMQTEKYKARQAAYRAFITATVPEKG(SEQ?ID?NO:1)；

(b)將SEQ?ID?NO:1氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽，所述功能是指催化槲皮素還原為二氫槲皮素的功能；

(c)與(a)限定的多肽序列有95％以上同源性，優選地98％以上同源性，更優地99％以上同源性，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。