[發明專利]一種新型冠狀病毒宏基因組測序引物、測序方法與應用

在審

• 申請號: 202111056541.2
• 申請日: 2021-09-09
• 公開（公告）號: CN113699277A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 郭彥
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6806;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 黃宗波

本發明涉及基因檢測技術領域，公開了一種新型冠狀病毒宏基因組測序引物、測序方法與應用，測序引物包括針對新型冠狀病毒分離毒株基因組全序列設計的60對特異性PCR擴增引物，所述60對特異性PCR擴增引物序列依次為SED ID No.1?SED ID No.120；測序方法步驟包括：測序樣本RNA反轉錄；測序樣本cDNA的特異性擴增，PCR擴增產物利用純化磁珠試劑進行純化；利用三代建庫試劑盒制備樣本文庫；將已建庫樣品進行上機測序。本發明能夠解決目前新型冠狀病毒宏基因組測序準確度較低、宏基因組測序流程時間較長的問題。

技術領域

本發明涉及基因檢測技術領域，尤其涉及一種新型冠狀病毒宏基因組測序引物、測序方法與應用。

背景技術

新型冠狀病毒肺炎是一種急性感染性肺炎，其病原體是一種新出現的新型冠狀病毒，被世界衛生組織命名為“2019-nCoV”。新型冠狀病毒屬于冠狀病毒β屬，為不分節段的單股正鏈RNA病毒，具包膜，其主要通過飛沫進行傳播，傳染能力強，感染人后初始癥狀多為發熱、乏力和干咳，并逐漸出現呼吸困難等嚴重表現，多數預后良好，部分嚴重病例可導致肺炎、嚴重急性呼吸綜合征、腎衰竭，甚至死亡。目前仍缺乏針對新冠病毒的有效抗病毒藥物。

目前，新型冠狀病毒在疫情過程中的變異趨勢和傳播規律仍然不明，因此獲得快速病毒基因組數據，實時監測病毒在疫情發展過程中的基因組變異情況；確定鏈式傳播的關鍵節點，追蹤可能存在的超級傳播者；能為疫情的精準防控提供有效數據支持。通過高通量測序平臺獲得新型冠狀病毒全基因組序列信息，其不僅有助于新型冠狀病毒的檢測，同時可針對病毒基因組變異的類型、位置及其對核酸檢測方法的影響等進行病毒變異監測，確定病毒傳播鏈，分析病毒變異監測及傳播進化。

現在常用的高通量測序平臺有二代高通量測序儀，如illumina測序平臺、ThermoFisher公司的Ion Torrent平臺，以及三代高通量測序平臺NanoPore。相比三代測序技術，二代測序技術平臺要完成整個樣本的反轉錄、PCR特異性擴增、建庫及上機數據分析的流程時間也較長，不利于測序結果的快速得出。三代測序技術也是單分子測序技術，不需要經過PCR擴增，建庫簡單，測序時間明顯短于二代測序平臺。同時三代NanoPore測序儀器便攜，可用于遠離實驗室的地區，如疫區，牧場等。但對于三代Nanopore測序平臺，直接用病毒RNA進行建庫時需要求起始核酸量較高(一般需要≥500ng)，一般新冠病毒患者咽拭子病毒基因組RNA核酸樣本濃度難以達到要求，使得測序的準確性較低，不利于基因組數據獲取，加大生物信息學分析的難度。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是提供一種新型冠狀病毒宏基因組測序引物、測序方法與應用，能夠解決目前新型冠狀病毒宏基因組測序準確度較低、宏基因組測序流程時間較長，不利于基因組數據獲取，加大生物信息學分析的難度的問題。

本發明通過以下技術手段解決上述技術問題：

一種新型冠狀病毒宏基因組測序引物，包括針對新型冠狀病毒分離毒株基因組全序列設計的60對特異性PCR擴增引物，所述60對特異性PCR擴增引物序列依次為SED IDNo.1-SED ID No.120，具體序列信息見實施例1。

本發明還公開了一種新型冠狀病毒宏基因組測序的方法，包括以下步驟：

S1、測序樣本RNA反轉錄；

S2、測序樣本cDNA的特異性擴增：使用針對自設計新冠病毒的60對特異性PCR擴增引物及QIAseq SARS-CoV-2 Primer Panel試劑盒引物對樣本cDNA進行PCR擴增，所述自設計的60對特異性PCR擴增引物序列依次為SED ID No.1-SED ID No.120；

S3、對步驟S2中PCR擴增的產物利用純化磁珠試劑進行純化；

S4、利用三代建庫試劑盒制備樣本文庫；