[發明專利]一種同時監測兩種microRNA的樹形核酸結構的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202111056446.2
• 申請日: 2021-09-09
• 公開（公告）號: CN113699228A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 項陽;段成杰;李大勇;龔幼靜
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6818
• 代理公司: 南京業騰知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32321
• 代理人: 繆友益

本發明公開了一種同時監測兩種阿爾茨海默病相關microRNA(miRNA)的樹形核酸結構的構建方法，在本方法中，兩種miRNA以相互依賴的形式維持分支鏈的生長，在此機制下，只有兩種miRNA同時存在時，才有可能形成樹枝形高聚物。通過熒光分子標記，可對此高聚物進行區分。所提出的方法能夠同時對兩種miRNA進行定量分析，有望成為一種高效分析miRNA的方法，用于早期診斷阿爾茨海默病及其他疾病相關的miRNA。

技術領域

本發明屬于基因技術領域，具體是涉及同時監測兩種microRNA的樹形核酸結構的構建方法。

背景技術

MicroRNA(miRNA)是一種小的非編碼RNA。其在細胞核內經DICER酶合成，被運輸至細胞質參與基因的轉錄和調控。為確保其正常功能，細胞產生了一些能夠整合miRNA的天然納米結構來進行遞送與調控。例如，外泌體可用于分揀與運送特定的miRNA至靶細胞參與細胞間的交流。另外，環狀RNA能作為分子海綿來整合冗余的miRNA以降低過表達帶來的損害。一個值得注意的例子是轉錄機器，多種miRNA常常協同參與轉錄機器的運行，促進基因表達調控。

受到這些結構的重要功能的啟發，人工的能夠整合功能性RNA的納米結構被合成出來。這些結構能夠模擬生物過程，促進其在生物醫藥領域的應用。其中，分支型核酸被認為是一種能夠整合不同功能模塊的理想材料。例如，RNA樹形分子能夠通過與miRNA雜交，在細胞內遞送miRNA，并進行miRNA成像。與此相似，帶有miRNA互補鏈的RNA膠束可以在體內結合多余的miRNA以抑制腫瘤的發展。然而，在這些方法中，分支的維持常常涉及多次加入預組裝的單體分子，這使得操作繁瑣耗時。另外，miRNA常常獨立地整合進這些結構，分別輸出信號，這就要求分別對捕獲過程進行分析。這使得多種miRNA的生物模擬分析效率很低。因此能夠以協同的方式一步整合不同miRNA的新型樹形結構將促進多種miRNA的生物模擬分析，并拓寬核酸納米結構的應用范圍。

此外，miRNA是一種重要的生物標志物。據報道，作為疾病標志物，不同miRNA的聯合檢測比單個檢測能更加準確的區分疾病。例如，阿爾茨海默癥是一種與多個miRNA(如miR-18b-5p和miR-342-3p)有關的神經退行性疾病。對兩種miRNA的同時分析被認為是早期診斷AD的有效指標。然而，傳統的方法很難完成對兩種標志物的同時分析。當前的方法，包括分子陣列，qPCR，RNA測序等，往往需要多次重復的操作。這限制了其在即時檢測中的應用。基于此，我們認為，基于樹形分子的異多價性和RNA的獨特性質，對于雙miRNA整合的樹形分子的探究有望運用于阿爾茨海默癥的早期快速診斷。

發明內容

發明目的：本發明目的在于針對現有技術的不足，提供一種同時監測兩種microRNA的樹形核酸結構的構建方法，能夠同時對兩種miRNA進行檢測，用于疾病早期診斷。

本發明的另一目的在于提供一種該方法在同時檢測疾病相關的兩種miRNA中的應用。

技術方案：本發明所述同時監測兩種miRNA的樹形核酸結構的構建方法，包括如下步驟：

(1)、準備待檢測疾病的兩種miRNA，分別為miR-1和miR-2，以及兩種連接DNA，分別為BL-1和BL-2，其中，BL-1的5’末端和3’末端能夠分別與一條miR-1的5’端和另一條miR-1的3’末端相連，BL-2的5’末端和3’末端能夠分別與一條miR-2的5’端和另一條miR-1的3’末端相連；

(2)、將步驟(1)中miR-1、miR-2、BL-1和BL-2分別溶于TE緩沖液中得到各自的溶液；

(3)、按一比一比例分別取BL-1溶液與BL-2溶液混合于雜交緩沖液中，然后按一比一比例向上述雜交緩沖液再加入miR-1溶液與miR-2溶液，將混合液先80℃～100℃變性10～20min，隨后在1℃～6℃下孵育2h，得到整合了兩種miRNA的核酸樹形分子。