[發(fā)明專利]淡水長臂大蝦小RNA病毒的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111052481.7
• 申請日: 2021-09-08
• 公開（公告）號: CN114369682B
• 公開（公告）日: 2023-09-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何建國;繆琪瑾;翁少萍;周丹丹
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6848;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

本發(fā)明公開了一種淡水長臂大蝦小RNA病毒的檢測方法，即MrPV?7的巢氏PCR和熒光定量PCR檢測方法，可用于篩選不帶毒的種蝦或蝦苗等，以減少淡水長臂大蝦養(yǎng)殖過程中的損失。本發(fā)明所建立的檢測淡水長臂大蝦小RNA病毒的巢氏PCR和熒光定量PCR方法的靈敏度高，特異性和重復性好，除了病毒的定性檢測外，還可進行定量檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于水產(chǎn)病毒的檢測技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種淡水長臂大蝦小RNA病毒的檢測方法。

背景技術(shù)

淡水長臂大蝦(Macrobrachium?rosenbergii)作為外來物種引入我國已有40多年歷史，因其經(jīng)濟效益顯著，成為了我國主要淡水養(yǎng)殖蝦類。但病害的發(fā)生使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展受到影響。國內(nèi)目前報道的可感染淡水長臂大蝦并引發(fā)病害的病毒有：白斑綜合征病毒(white?spot?syndrome?virus，WSSV)，野田村病毒(Macrobrachium?RosenbergiiNodavirus，MrNV)以及細小病毒樣病毒(parvo-like?virus，HPV)等，還有一些病害尚未明確病原。隨著對水產(chǎn)疾病研究的深入，越來越多的證據(jù)表明，導致同種水產(chǎn)疾病的可能不只有一種病毒，例如白尾病的病原就有野田村病毒(MrNV)和可能作為MrNV衛(wèi)星病毒或輔助病毒的極小病毒(extra?small?virus-like?particles，XSV)兩種。

“鐵殼蝦”病的出現(xiàn)使得淡水長臂大蝦的產(chǎn)量顯著下降，確立“鐵殼蝦”病的病原，建立相應的檢測方法，對淡水長臂大蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康和長遠發(fā)展具有重大意義。本發(fā)明通過對表現(xiàn)出“鐵殼”癥狀的蝦體內(nèi)的病毒進行富集以及宏病毒組測序，發(fā)現(xiàn)了一種新的小RNA病毒，暫將其命名為Macrobrachium?rosenbergii?picorna?virus?7(MrPV-7)。針對此病毒建立一種快速、準確、靈敏且特異性強的檢測方法，將有助于及早確認養(yǎng)殖的淡水長臂大蝦中是否有感染MrPV-7，以便對潛在風險進行針對性處理。

針對水產(chǎn)動物病毒病原進行檢測的方法有原位雜交、酶聯(lián)免疫吸附、PCR及LAMP等，在實際檢測過程中，原位雜交和酶聯(lián)免疫吸附耗時長且靈敏度不高，LAMP則存在假陽性較高的情況。巢式PCR法對靶序列的檢測靈敏度和特異性高，現(xiàn)已廣泛應用于水產(chǎn)疾病的檢測，如李晨等建立了櫛孔扇貝急性病毒性壞死病毒巢式PCR檢測方法(李晨,王崇明,曲朋,等.櫛孔扇貝急性病毒性壞死病毒巢式PCR檢測方法的建立[J].水產(chǎn)學報,2013,37(002):281-287.)。熒光定量PCR法的耗時更短，且通過和絕對定量標準曲線的比對，可以對樣品進行定量檢測，也已廣泛應用于水產(chǎn)疾病的檢測，如劉寶彬等構(gòu)建的凡納濱對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒及蝦肝腸胞蟲的熒光定量PCR檢測方法(劉寶彬,楊冰,呂秀旺,等.凡納濱對蝦(Litopenaeus?vannamei)傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)及蝦肝腸胞蟲(EHP)的熒光定量PCR檢測[J].漁業(yè)科學進展,2017,38(002):158-166.)，但目前還未有針對MrPV-7的PCR檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷和不足，提供一種淡水長臂大蝦小RNA病毒的檢測方法，即MrPV-7的檢測方法。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種淡水長臂大蝦小RNA病毒的檢測方法。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于檢測淡水長臂大蝦小RNA病毒的靶序列。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于檢測所述靶序列的引物組。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種淡水長臂大蝦小RNA病毒的檢測試劑盒。

本發(fā)明的第五個目的是提供所述靶序列在制備檢測淡水長臂大蝦小RNA病毒的產(chǎn)品中的應用。

本發(fā)明的第六個目的是提供所述引物組在制備檢測淡水長臂大蝦小RNA病毒的產(chǎn)品中的應用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：