[發(fā)明專利]一種烏飯樹實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111048325.3
• 申請日: 2021-09-08
• 公開（公告）號: CN114292901A
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖家欣;何鋒;桂良仙;張曉平;樊基勝;張春龍
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽師范大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6809
• 分類號: C12Q1/6809
• 代理公司: 北京潤平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11283
• 代理人: 董杰

1.一種烏飯樹實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)利用烏飯樹轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，挑選N個烏飯樹候選內(nèi)參基因，以挑選的N個所述烏飯樹候選內(nèi)參基因為模板，分別設(shè)計實時熒光定量PCR的內(nèi)參基因引物對，其中N≥2；

(2)以烏飯樹組織的RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，以所述內(nèi)參基因引物對為反應(yīng)引物對，進(jìn)行實時熒光定量PCR分析；

(3)將所述實時熒光定量PCR得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進(jìn)行分析，篩選出最優(yōu)內(nèi)參基因和/或內(nèi)參基因組合。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(1)中所述烏飯樹候選內(nèi)參基因為肌動蛋白1、肌動蛋白2、肌動蛋白3、肌動蛋白4、肌動蛋白5、核糖體蛋白、泛素結(jié)合酶、泛素蛋白基因、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶，所述肌動蛋白1、肌動蛋白2、肌動蛋白3、肌動蛋白4、肌動蛋白5、核糖體蛋白、泛素結(jié)合酶、泛素蛋白基因、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述肌動蛋白1、肌動蛋白2、肌動蛋白3、肌動蛋白4、肌動蛋白5、核糖體蛋白、泛素結(jié)合酶、泛素蛋白基因、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶對應(yīng)的所述內(nèi)參基因引物對的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.11-SEQ IDNO.30所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述設(shè)計實時熒光定量PCR的內(nèi)參基因引物對的過程包括：利用Primer Premier軟件提供多個與所述烏飯樹候選內(nèi)參基因合適的備選引物對，將所述備選引物對進(jìn)行評分和特異性評價，篩選出該烏飯樹候選內(nèi)參基因?qū)?yīng)的所述內(nèi)參基因引物對。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征在于，所述評分的條件包括：

a、引物的長度在20-24bp之間；

b、引物3’端的5個堿基中含有1-3個G、C，末尾不是A；

c、擴增長度在80-150bp之間；

d、引物序列的GC含量在50％-60％范圍內(nèi)；

e、引物序列自身二聚體和交叉二聚體連續(xù)的堿基數(shù)少于4個，不連續(xù)的少于7個；

f、沒有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的二聚體。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征在于，所述特異性評價通過所述實時熒光定量PCR的溶解曲線進(jìn)行評價。

7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任意一項所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，以1μg所述烏飯樹組織的RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為基準(zhǔn)，所述內(nèi)參基因引物對中的每條引物的用量為0.1×10^-3-1×10^-3μmol。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的篩選方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR的反應(yīng)程序為：90-100℃預(yù)變10-20min；90-100℃解鏈5-15s，55-65℃退火25-35s，反應(yīng)35-45個循環(huán)。

9.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任意一項所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，所述烏飯樹組織選自烏飯樹果實、烏飯樹葉片和烏飯樹嫩根中的至少一種。