[發明專利]農田土壤健康診斷的土壤動物活性生物傳感器的獲得方法

有效

• 申請號: 202111039718.8
• 申請日: 2021-09-06
• 公開（公告）號: CN113740511B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發明（設計）人: 高梅香;李加林;朱家祺
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N33/24
• 分類號: G01N33/24;A01K15/00
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 朱玲艷

1.農田土壤健康診斷的土壤動物活性生物傳感器的獲得方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：對農田土壤動物活性生物傳感器的綠色生態浮標進行篩選：

①、采集野外農田中的土壤動物，將采集到的活體土壤動物帶回實驗室：在野外農田中收集農田土壤動物，將采集的土壤動物樣品放入標本瓶或者標本盒中，將捕食者和被捕食者、競爭者之間隔離開；之后蓋上蓋子防止土壤動物逃跑，用工具在蓋子上扎一些小孔，保證標本瓶或標本盒內有足夠的空氣，小孔的孔徑小于2mm，防止里面的土壤動物逃跑出來；然后，向標本瓶或標本盒中放入原位土壤顆粒和凋落葉；使用土柱法在野外農田中采集深度為15cm的土柱或者土方，將其放入布袋或者自封袋中，帶回實驗室待分離土壤中數量占優勢的螨和跳蟲；

②、挑揀和分離采集到的土壤動物樣品，分別置于培養盒中進行培養，采用高清攝像頭實時自動監測土壤動物活動規律：

將放在標本瓶或標本盒內的土壤動物進行初步分類和整理，將其按照類群分別放置在不同的培養盒中；培養盒底層平鋪過2mm篩的10cm厚原位農田土壤，上覆農作物或雜草秸稈，模擬野外農田土壤自然環境條件，將土壤調節到野外農田平均土壤溫度和濕度水平；按照不同類群的食物喜好，分別往培養盒中投放不同的食物資源，對于同一物種和類群，進行規范化培養和養殖，每次投放相同的、等量的食物資源；

對于前述從野外帶回的土柱或者土方，采用干漏斗法分離從野外帶回的土柱或者土方中中型土壤動物；在干漏斗最下方，使用配置了培養基的培養盒，用于直接分離和獲取活體土壤跳蟲和螨；分離結束后，將跳蟲和螨分隔到不同的培養盒中培養，這些培養盒的材質和規格同前述培養盒，內置配置好的標準化培養基；對于同一物種和類群，進行規范化培養和養殖，每次投放相同的、等量的食物資源；

將培養盒放到恒溫濕培養箱中，將土壤溫度和濕度調節到野外農田平均土壤溫度和濕度水平；或者將培養盒直接放到實驗室內，在室溫條件下培養和繁殖；在整個培養過程中，將高清攝像頭置于培養盒的上方，實時自動監測土壤動物的活動狀態，將自動監測的數據及時導入數據庫；

③、篩選數量多的、可供培養的、能在實驗室大量繁殖和生長的土壤動物：

定期定時對培養盒中的土壤動物進行檢查和測量，獲取基本參數以判斷哪些土壤動物可以作為土壤動物活性生物傳感器的綠色生態浮標；檢查和測量的屬性數據包括：

基本屬性：物種數量、個體數量、生物量、體長、體寬、體色、產卵數量、幼體數量；

活動特征：單位時間內活動次數、移動方向、移動距離、移動時間、打斗次數、打斗程度、競爭結果；

經過40天的培養之后，選擇符合基本屬性和活動特征的物種和種群，將其作為進入下一個篩選環節的對象，也作為土壤動物活性生物傳感器所需綠色生態浮標的候選者；要求如下：(1)基本屬性方面：個體數量不變或增加、平均生物量不變或增加、平均體長和體寬不變或增加、平均產卵數量不變或增加、平均幼體數量不變或增加；(2)活動特征：單位時間內活動次數基本保持穩定、單位時間內移動距離基本保持穩定；選擇基本屬性和活動特征處于平均水平的物種和種群，使其進入下一個篩選環節，將這些土壤動物物種和種群稱為土壤動物活性生物傳感器所需綠色生態浮標的候選者；

④、培養土壤動物活性生物傳感器所需綠色生態浮標的候選者，獲得同步化的物種和種群：

培養和繁殖前述選擇的土壤動物活性生物傳感器所需綠色生態浮標的候選者，對其進行繁殖，獲得同步化的物種、個體和種群；在此期間，記錄培養過程的環境條件、基本屬性、活動特征和發生的所有狀況，將自動監測設備獲取資料導入數據庫；

⑤、設置不同濃度的農藥梯度實驗，篩選對土壤環境變化具有敏感性、靈敏性和耐受性的土壤動物的物種和種群，將其作為土壤動物活性生物傳感器所需綠色生態浮標的物種和種群：

步驟1的⑤分為六步：

第一步，準備培養盒，對于大型土壤動物，選擇前述底部平鋪過2mm篩的10cm厚原位農田土壤培養盒，將前述大型土壤動物放置在培養盒內；對于中型土壤動物，選擇配置了培養基并平鋪過2mm篩的1cm厚原位農田土壤的培養盒，將前述跳蟲和螨放置在培養盒內；

第二步，將前述步驟1的④中同步化的土壤動物分別轉移到培養盒中；

第三步，選擇一種農藥，根據當地農民使用農藥的劑量習慣，分別設置無農藥和低濃度、中濃度和高濃度農藥這4個梯度；根據當地農民施用農藥的習慣，分別將四個梯度的農藥噴灑到前述第二步的培養盒中；

第四步，實時自動監測土壤動物的動態特征：在培養盒的上方安置高清攝像頭，實時自動監測不同農藥梯度下土壤動物的動態特征；

第五步，定期定時收割培養盒中土壤動物，測量土壤動物的基本屬性和活動特征參數：每隔7天定期定時收獲一次培養盒中的土壤動物，分別獲取土壤動物的基本參數和活動特征，將獲取的數據及時導入數據庫；

第六步，整理分析第一個試驗周期獲得的所有數據，運行評估土壤動物活性生物傳感器的算法和模型，根據評估結果篩選出可用作土壤動物活性生物傳感器的綠色生態浮標的物種和種群；

⑥、設置不同濃度的農藥梯度實驗，將前述篩選出的土壤動物活性生物傳感器所需綠色生態浮標的物種和種群進行組合與培養，篩選對土壤環境變化具有敏感性、靈敏性和耐受性的土壤動物群落，將其作為土壤動物活性生物傳感器所需的綠色生態浮標群落：

根據前述篩選出的土壤動物活性生物傳感器物種和種群，對篩選出的未經過農藥梯度實驗的土壤動物活性生物傳感器所需綠色生態浮標的候選者，進行多種組合形成不同的土壤動物群落；重復步驟1的⑤中第一步到第六步的實驗過程，篩選出對土壤環境變化具有敏感性、靈敏性和耐受性的土壤動物群落，以此作為土壤動物活性生物傳感器所需的綠色生態浮標群落；

⑦、至少經過3個實驗周期之后，確定篩選出的土壤動物活性生物傳感器所需的綠色生態浮標物種、種群和群落：

完成第一個實驗周期的篩選之后，再進行第二個和第三個實驗周期的篩選，將那些評估合格的物種、種群和群落，作為土壤動物活性生物傳感器所需綠色生態浮標物種、種群和群落，經過室內培養、野外復雜環境條件下的驗證和室內再次培養之后，將其用于野外農田土壤健康診斷的實踐中；

步驟2：基于一種農田土壤動物活性生物傳感器野外實驗裝置對農田土壤動物活性生物傳感器綠色生態浮標進行野外馴化：

①.在野外采集0-15cm原位農田土壤，帶回實驗室，在室內自然風干，過2mm篩后備用；

②.將步驟1篩選出的綠色生態浮標進行批量化、同步化培養，對同步化的綠色生態浮標進行測量，測量參數包括其生物量、體長、體寬、體色，然后將這些綠色生態浮標放置在一種農田土壤動物活性生物傳感器野外實驗裝置中，待野外馴化使用；

③.在野外農田中，使用消毒后的工具挖取0-15cm深的圓柱形土坑，每一種綠色生態浮標至少挖取30個土坑；

④.設置和運行一種農田土壤動物活性生物傳感器野外實驗裝置，將農田土壤動物活性生物傳感器綠色生態浮標安置在一種農田土壤動物活性生物傳感器野外實驗裝置中：

(1)將一種農田土壤動物活性生物傳感器野外實驗裝置的下層生態箱安置到土坑內，其底部直接接觸原位農田土壤，然后將一種農田土壤動物活性生物傳感器野外實驗裝置生態箱中儀器設備所使用的電線鋪設好，電線從下層生態箱的底部接出去，直接接入一種農田土壤動物活性生物傳感器野外實驗裝置生態箱中的電線管；

將過2mm篩的土壤平鋪到下層生態箱中，要一層一層的從下層到上層平鋪，當土壤和下層生態箱頂部齊平的時候，使用橡膠錘輕輕拍打，使土壤平整；然后使用噴壺噴灑水，水量根據農田下層土壤含水量計算應該噴灑的水的體積，使下層生態箱中土壤含水量與田間下層土壤含水量持平；

將一種農田土壤動物活性生物傳感器野外實驗裝置中的連接圈扣上，將一種農田土壤動物活性生物傳感器野外實驗裝置中儀器設備的電線穿過下層紗網的篩孔，然后使一種農田土壤動物活性生物傳感器野外實驗裝置中的下層紗網連接并扣緊下層生態箱；

(2)將中層生態箱安置到土坑內，通過連接圈和下層生態箱連接；將儀器設備的電線連接上中層生態箱中的土壤傳感器，包括一種農田土壤動物活性生物傳感器野外實驗裝置中的土壤溫濕度傳感器、土壤pH值傳感器、土壤氮磷鉀傳感器和土壤電導率傳感器；

然后將過2mm篩的土壤平鋪到中層生態箱中，要一層一層的從下層到上層平鋪，當土壤和中層生態箱頂部齊平的時候，用小鐵鍬輕輕拍打，使土壤平整；然后使用噴壺噴灑水，水量根據農田中層土壤含水量計算應該噴灑的水的體積，使中層生態箱中土壤含水量與田間中層土壤含水量持平；

然后調整土壤傳感器的位置，使其位于中層生態箱的頂部、中層紗網的下部，土壤傳感器的探頭應被埋沒在土壤中，不能碰到中層紗網；

(3)將上層生態箱安置到土坑內，通過連接圈和中層生態箱連接；將儀器設備的電線連接上層生態箱中的高清攝像頭和聲音記錄儀；

將過2mm篩的土壤平鋪到上層生態箱中，要一層一層的從下層到上層平鋪，其厚度為1.5cm，上部距離上層生態箱邊緣0.5cm空間內不鋪設過2mm的土壤，用帶了一次性實驗手套的手拍打，使土壤表面平整；然后使用噴壺噴灑水，水量根據農田上層土壤含水量計算應該噴灑的水的體積，使上層生態箱中土壤含水量與田間上層土壤含水量持平；

準備高清攝像頭和聲音記錄儀，將它們固定在上層生態箱的未鋪設土壤區域的PVC板的內壁上；

將同步化的綠色生態浮標放入上層生態箱的土壤表面，依據使用的綠色生態浮標特點設置放入的數量；

然后使用連接圈，將上層紗網固定到上層生態箱，使其與農田土壤表層齊平；

(4)處理生態箱附近的農田地表土壤，使其接近自然農田地表土壤；

⑤.逐日自動監測與檢查、記錄、整理、分析綠色生態浮標動態：

基于一種農田土壤動物活性生物傳感器野外實驗裝置實時自動監測并及時檢查生態箱內綠色生態浮標的狀態與活動特征；在整個野外馴化過程中，定時進行檢查、記錄、整理與分析綠色生態浮標的狀態與活動特征，以作為綠色生態浮標野外馴化結果的評估依據；

⑥.野外馴化的第2、4、6、8、10、12、14、16、18天，分別取回野外馴化的生態箱中的綠色生態浮標，保證每種綠色生態浮標取回3個重復生態箱，取其平均野外馴化狀態，用來評估野外馴化結果；

⑦.在室內測量取回的綠色生態浮標的基本屬性參數，包括生物量、體長、體寬、體色等，結合步驟2的⑤中自動監測獲取的數據，對野外馴化結果進行評估；

在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天中，當綠色生態浮標的生物量、體長、體寬、體色保持不變或增加，當綠色生態浮標的每日移動距離、單位時間內活動次數、移動方向保持平均穩定狀況，即選擇該天數為野外馴化的時間；

⑧.以該綠色生態浮標為對象，重復步驟2的①-⑦，批量馴化綠色生態浮標，并將野外馴化后的綠色生態浮標用于農田土壤健康評估的實踐過程中。