[發明專利]一株異源表達組蛋白去乙?；敢种苿〧K228的工程菌株及其構建與應用

在審

• 申請號: 202111038045.4
• 申請日: 2021-09-06
• 公開（公告）號: CN113699089A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 李瑞娟;宋超逸;張友明;李愛英;王茂芹;王宗杰;宮愷
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/52;C12N15/74;C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

1.一株異源表達組蛋白去乙?；敢种苿〧K228的工程菌株，其特征在于：該工程菌株命名為工程菌株E264::R-tdp-dep，其基因型為：Burkholderia thailandensis E264ΔoprABCΔtdpDE5kb,apramycin resistance,tdpR,tdpA,tdpB,tdpC1,tdp-depDE,tdpF,tdpG,tdpH,tdpI and tdpJ，是利用Burkholderia thailandensis E264ΔoprABCΔtdpDE5kb為出發菌株，通過轉座的方法在其基因組上整合了組合生物合成基因簇R-tdp-dep獲得。

2.權利要求1所述異源表達組蛋白去乙酰化酶抑制劑FK228的工程菌株的構建方法，步驟是：

(1)利用ExoCET組裝技術將合成的depD和depE基因三片段PartI、PartII、PartIII與載體pBR322-amp-ccdB片段進行組裝，構建得到質粒pBR322-amp-ccdB-depD-depE；

(2)利用Red/ET同源重組技術，將km-ccdB片段替換質粒p15A-cm-tdp中的tdpDE基因，構建得到質粒p15A-cm-tdp-delDE-km-ccdB；

(3)利用限制性內切酶PacI對步驟(1)構建的質粒pBR322-amp-ccdB-depD-depE進行酶切得到depDE線性片段，利用限制性內切酶BstZ171和BamHI對步驟(2)構建的質粒p15A-cm-tdp-delDE-km-ccdB進行雙酶切釋放載體p15A-cm-tdp-deltdpDE線性片段；然后兩個線性片段在體外通過T4 DNA聚合酶進行處理，然后將其電轉到E.coli GB2005中，得到質粒p15A-cm-tdp-dep；

(4)利用Red/ET同源重組技術，在步驟(3)構建的質粒p15A-cm-tdp-dep上插入km-ccdB用于敲除四環素啟動子，得到質粒p15A-cm-dep-deltetR-km-ccdB；

(5)利用限制性內切酶BstZ171對質粒p15A-cm-dep-deltetR-km-ccdB進行酶切釋放載體p15A-cm-dep-deltetR-km-ccdB線性片段；p15A-cm-dep-deltetR-km-ccdB線性片段與tdpR在體外通過T4 DNA聚合酶進行處理，然后將其電轉到E.coli GB2005中，得到質粒p15A-cm-R-tdp-dep；

(6)在步驟(5)構建的質粒p15A-cm-R-tdp-dep中分別插入轉座元件，構建得到表達質粒p15A-apra-tnpA-R-tdp-dep；

(7)將表達質粒p15A-apra-tnpA-R-tdp-dep電轉至E.coli WM3064中，然后與Burkholderia thailandensis E264ΔoprABCΔtdpDE5kb進行結合轉移，最終將組合生物合成基因簇R-tdp-dep整合到宿主染色體上，得到了能生產FK228的工程菌株，命名為工程菌株E264::R-tdp-dep。

3.權利要求1所述異源表達組蛋白去乙?；敢种苿〧K228的工程菌株在制備FK228中的應用。

4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：

所述異源表達組蛋白去乙?；敢种苿〧K228的工程菌株發酵制備FK228的方法是：

一級種子培養：保藏的種子E264::R-tdp-dep用接種環挑取一環劃平板于固體LB培養基上，在37±1℃恒溫培養箱中培養12±2h；

二級種子培養：用接種環挑取培養好的一級種子，接入裝液量為50mL液體LB培養基的250mL搖瓶中，在37±1℃、180±20r·min^-1條件下培養16±2h；

發酵培養：將二級種子按體積比1％接種量接入裝液量為65mL發酵培養基的250mL搖瓶中，在28±1℃、180±20r·min^-1的條件下培養12±2h；加入終濃度重量比4％的XAD-16大孔吸附樹脂懸浮液，28±1℃、180±20r·min^-1的條件下繼續培養38±2h，得到含FK228的發酵液；

所述含FK228的發酵液的分離方法是：

將含FK228的發酵液常規離心收集樹脂和菌體，冷凍干燥；用二氯甲烷浸泡產物4±1h，抽濾分離浸提液，重復3±1次，合并浸提液，低壓濃縮干燥獲得粗提物；

用液相初步分離純化：以超純水為流動相A，以色譜純乙腈為流動相B，梯度洗脫條件為0–5min 30％B,5–60min 30–80％B,8mL/min；收集流份，獲得FK228粗品；

HPLC分離純化：以超純水為流動相A，以色譜純乙腈為流動相B，梯度洗脫條件為0–5min5％B,5–60min 5–45％B,3mL/min，收集流份，低壓濃縮干燥，獲得FK228純品。