[發(fā)明專利]一種通過強(qiáng)化枯草芽孢桿菌功能膜微域提高七烯甲萘醌產(chǎn)量的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111035771.0
• 申請(qǐng)日: 2021-09-06
• 公開（公告）號(hào): CN113736815B
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉龍;陳堅(jiān);呂雪芹;堵國(guó)成;李江華;劉延峰;董雅君;金柯;張智航;王凌銳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/75
• 分類號(hào): C12N15/75;C12N1/21;C12N15/31;C12P7/66;C12R1/125
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 張榮

本發(fā)明公開了一種通過強(qiáng)化枯草芽孢桿菌功能膜微域提高七烯甲萘醌產(chǎn)量的方法，本發(fā)明的方法是通過強(qiáng)化表達(dá)產(chǎn)七烯甲萘醌的枯草芽孢桿菌功能膜微域中的腳手架蛋白FloA。本發(fā)明通過對(duì)已高產(chǎn)MK?7的重組枯草芽孢桿菌BS20中的腳手架蛋白使用強(qiáng)啟動(dòng)子P43進(jìn)行強(qiáng)化，增加FMMs在細(xì)胞質(zhì)膜上的占比后，進(jìn)一步提高了MK?7的產(chǎn)量，與對(duì)照菌株BS20相比，強(qiáng)化FloA的重組枯草芽孢桿菌BSQ1產(chǎn)量最高，發(fā)酵6天后，BSQ1菌株產(chǎn)量達(dá)到417.08mg/L，較BS20菌株提升了16.57％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種通過強(qiáng)化枯草芽孢桿菌功能膜微域提高七烯甲萘醌產(chǎn)量的方法，屬于代謝技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

維生素K作為一類重要的脂溶性維生素，是人體不可缺少的重要維生素之一，在加速凝血、預(yù)防心血管硬化和治療骨質(zhì)疏松等方面起著關(guān)鍵作用。維生素K以2-甲基-1,4-萘醌為骨架，根據(jù)C3位支鏈結(jié)構(gòu)的不同，可將維生素K分成不同的亞型。其中七烯甲萘醌(Menaquinone-7,MK-7)由于具有在人體中半衰期長(zhǎng)、親緣性高等特點(diǎn)，目前在功能性食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域備受關(guān)注。發(fā)明人課題組前期申請(qǐng)的中國(guó)專利目CN110157749B已在枯草芽孢桿菌中達(dá)到了較高M(jìn)K-7產(chǎn)量，但是在研究中發(fā)現(xiàn)常規(guī)的代謝改造，如強(qiáng)化合成途徑、阻斷副產(chǎn)物的形成等，很難進(jìn)一步提高M(jìn)K-7的產(chǎn)量。

功能膜微域(Functional Membrane Microdomains,FMMs)是細(xì)菌細(xì)胞脂膜上富含固醇類似物聚異戊二烯化合物的一類結(jié)構(gòu)致密性微域，并且富含特殊的腳手架蛋白。這類腳手架蛋白作為一種膜結(jié)合伴侶蛋白，僅定位在FMMs上，可以招募需要定位在FMMs上的蛋白并促進(jìn)這些蛋白的相互作用以及寡聚化，在組織和形成FMMs的過程中起到重要作用。目前還沒有研究表明是否能夠通過對(duì)枯草芽孢桿菌中的FMMs進(jìn)行強(qiáng)化，增加FMMs在細(xì)胞質(zhì)膜中的占比，增加MK-7在細(xì)胞質(zhì)膜上的存儲(chǔ)空間以提高M(jìn)K-7的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過對(duì)FMMs中的FloA、FloT蛋白進(jìn)行強(qiáng)化，增加FMMs在細(xì)胞質(zhì)膜上的占比后，進(jìn)一步提高了MK-7的產(chǎn)量。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種通過強(qiáng)化枯草芽孢桿菌功能膜微域提高七烯甲萘醌產(chǎn)量的方法，所述方法是通過強(qiáng)化表達(dá)產(chǎn)七烯甲萘醌的枯草芽孢桿菌功能膜微域中的腳手架蛋白FloA。

進(jìn)一步地，所述的強(qiáng)化表達(dá)是通過使用強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行強(qiáng)化表達(dá)。

進(jìn)一步地，所述的強(qiáng)啟動(dòng)子為P43啟動(dòng)子。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種產(chǎn)七烯甲萘醌的枯草芽孢桿菌重組菌，所述的枯草芽孢桿菌重組菌是通過強(qiáng)化表達(dá)枯草芽孢桿菌宿主功能膜微域中的腳手架蛋白FloA獲得。

進(jìn)一步地，所述的強(qiáng)化表達(dá)是通過使用強(qiáng)啟動(dòng)子P43進(jìn)行強(qiáng)化表達(dá)。

進(jìn)一步地，所述的強(qiáng)啟動(dòng)子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

進(jìn)一步地，所述的枯草芽孢桿菌宿主為枯草芽孢桿菌BS20。枯草芽孢桿菌BS20在專利CN110157749B中公開。

進(jìn)一步地，所述的腳手架蛋白FloA的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述的枯草芽孢桿菌重組菌在發(fā)酵生產(chǎn)七烯甲萘醌中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述應(yīng)用具體是將重組枯草芽孢桿菌在種子培養(yǎng)基中活化，然后將活化后的種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得七烯甲萘醌。

本發(fā)明的有益效果是：