[發(fā)明專利]一種利用印度洋交替單胞菌制備普魯蘭酶的方法

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• 申請日: 2021-09-01
• 公開（公告）號: CN114164195A
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發(fā)明（設計）人: 陳顥;何培青;王宗靈
• 申請（專利權）人: 自然資源部第一海洋研究所;中國大洋礦產(chǎn)資源研究開發(fā)協(xié)會;中國大洋事務管理局
• 主分類號: C12N9/44
• 分類號: C12N9/44;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 山東重諾律師事務所 37228
• 代理人: 劉衍軍

1.一種利用印度洋交替單胞菌制備普魯蘭酶的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)菌株Alteromonas sp.162的發(fā)酵

將試管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接種于液體培養(yǎng)基中，所述液體培養(yǎng)基組成為普魯蘭多糖5-10g，蛋白胨0-1g，酵母粉0.1-0.25g，陳海水1000mL，pH值7.0-7.2；培養(yǎng)基于100-120℃滅菌30-50min；冷卻后，將試管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接種到500mL的三角瓶中，其中含300mL培養(yǎng)基，于10-15℃，200-250rpm下振蕩培養(yǎng)24-48h后，得發(fā)酵液；

(2)菌株Alteromonas sp.162的普魯蘭酶編碼基因pulA的克隆

收集產(chǎn)酶菌體，提取基因組；采用普魯蘭酶編碼基因的引物，pul-F5’-CGCGGATCCATGTTAACGAAACC-3'，pul-R5’-CCGCTCGAGTTTTGCGCTCACGGT-3'進行PCR擴增；PCR體系為50μL，包括：基因組DNA，1μL；10μM pul-F，1μL；10μM pul-R，1μL；5×PCR緩沖液，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH₂O，32μL；PCR反應條件：預變性溫度95℃，3min；變性溫度95℃，30sec；退火溫度57℃，30sec；延伸溫度72℃，3min；35個循環(huán)；總延伸72℃，5min；獲得擴增產(chǎn)物；

取25-50μL擴增產(chǎn)物進行回收，將回收的目的基因pulA與pEASY-Blunt克隆載體進行連接，連接體系為5μL，包括：目的DNA，4μL；pEASY-Blunt克隆載體，1μL；將所述連接體系輕輕混合，室溫下反應30-60min獲得重組質(zhì)粒pEASY-Blunt+pulA；將重組質(zhì)粒pEASY-Blunt+pulA轉入E.coli DH5α感受態(tài)細胞，取200μL轉化后的重組細胞E.coli DH5α涂布于含有終濃度為50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板上，置于37℃過夜培養(yǎng)；

挑取平板上的單克隆，利用PCR方法鑒定插入了目的基因pulA的陽性克隆；通用引物為M13-F5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3'，M13-R5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；PCR體系為50μL，包括：基因組E.coli DH5α，1μL；10μM M13-F，1μL；10μM M13-R，1μL；5×PCR Buffer，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH₂O，32μL；PCR反應條件：預變性95℃，3min；變性溫度95℃，30sec；退火溫度50℃，30sec；延伸溫度72℃，3min；35個循環(huán)；總延伸72℃，5min；反應后取5μL擴增產(chǎn)物，于1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，能擴增出目的條帶即為陽性克隆；將陽性克隆接種到含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃、180rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)過夜后10000rpm離心10min，收集菌體，提取重組質(zhì)粒pEASY-Blunt+pulA，并進行測序；

(3)菌株Alteromonas sp.162的普魯蘭酶編碼基因PulA序列分析

通過序列比對，普魯蘭酶基因PulA的ORF全長是4347bp，編碼了一個含有1449個氨基酸的蛋白質(zhì)PulA；該蛋白質(zhì)PulA與來源于Alteromonas sp.的普魯蘭酶具有較近的親緣關系；該蛋白質(zhì)PulA理論分子量為158.68kDa，屬于PulA超家族；

(4)菌株Alteromonas sp.162的普魯蘭酶重組質(zhì)粒構建

采用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI分別對重組質(zhì)粒pEASY-Blunt+pulA與表達載體質(zhì)粒pET-28a(+)進行雙酶切，重組質(zhì)粒酶切體系為50μL，包括：XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart緩沖液，5μL；重組質(zhì)粒，10μL；ddH₂O，33μL；表達質(zhì)粒pET-28a(+)酶切體系為50μL，包括XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart緩沖液，5μL；表達質(zhì)粒，5μL；ddH₂O，38μL；將反應體系混合均勻后，置于37℃水浴鍋中保溫30min；

將回收、純化的目的基因pulA與表達載體pET-28a(+)進行連接；連接體系為20μL，包括：T4 DNA ligase，1μL；T4 DNA ligase緩沖液，2μL；pulA，12μL；載體，5μL；將連接體系輕輕混勻，置于16℃過夜；反應結束后所得的重組質(zhì)粒為pET28a+PulA；

(5)普魯蘭酶PulA的誘導表達

將重組質(zhì)粒pET28a+PulA轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞E.coli BL21(DE3)，隨后取200μL轉化后的重組細胞E.coli BL21(DE3)-pET28a+PulA涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板上，置于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；

采用T7通用引物T7-p5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，T7-ter5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'對目的基因pulA進行PCR擴增，鑒定陽性克隆；將陽性克隆接種到含卡那霉素50μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃、180rpm下振蕩培養(yǎng)，作為種子液；再以1.0％的接種量將其接種于300mL含有50μg/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，16℃、150rpm下振蕩培養(yǎng)；當菌液濃度達到OD₆₀₀為0.6-0.8時，加入終濃度為0.2mM的IPTG后繼續(xù)置于16℃、150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)過夜；將誘導培養(yǎng)后的重組菌株BL21(DE3)-pET28a+pulA于4℃、7500rpm下離心15min，沉淀菌體采用PBS緩沖液洗滌兩次后再重懸于20mL PBS緩沖液中，于高壓細胞破碎儀中進行細胞破碎，4℃、10000pm下離心30min，得到胞內(nèi)可溶組分；

(6)普魯蘭酶PulA的純化

首先用10倍柱體積的ddH₂O清洗鎳柱，再用5倍柱體積的結合緩沖液平衡鎳柱；然后將要純化的樣品進行上樣；上樣后再用5倍柱體積的結合緩沖液洗去未結合的雜蛋白；最后用3倍柱體積的洗脫緩沖液洗脫帶有His標記的目的蛋白，收集各個組分，進行SDS-PAGE驗證純化蛋白，獲得普魯蘭酶；

(7)菌株Alteromonas sp.162普魯蘭酶截斷突變體的構建

利用primer premier 6.0設計普魯蘭酶截斷突變體引物，Puld5-F5'-CCGCTCGAGCAAACCGTAACCTTGTGCGC-3'，Puld5-R5'-CGCGGATCCCAGTACATGCTCTGAAGTCA-3'，以步驟(2)獲得的含普魯蘭酶基因pulA的質(zhì)粒為模板，擴增點截斷變體基因puld5，擴增條件同步驟(2)，退火溫度重新設為52℃；對puld5基因進行回收、連接轉化，獲得重組質(zhì)粒pEASY-Blunt+Puld5，條件同步驟(2)；通過測序驗證截斷突變體的基因序列；

(8)菌株Alteromonas sp.162普魯蘭酶截斷突變體異源表達和純化

對重組質(zhì)粒pEASY-Blunt+Puld5與表達載體質(zhì)粒pET-28a(+)進行雙酶切，并制備含目的基因puld5的重組質(zhì)粒pET28a+Puld5，條件同步驟(2)；重組質(zhì)粒pET28a+Puld5異源表達條件同步驟(5)，純化條件同步驟(6)；

(9)菌株Alteromonas sp.162普魯蘭酶點突變體構建

利用primer premier 6.0設計點突變體引物，H611Q-F5'-TGGGGTTATGATCCACAACATTTTAACGCTC-3'，H611Q-R5'-TTGTGGATCATAACCCCAATTAAAACCATCA-3'，以步驟(2)獲得的含普魯蘭酶基因pulA的質(zhì)粒為模板，擴增點截斷變體基因h611Q，擴增條件同步驟(2)；對h611Q基因進行回收、連接轉化，獲得重組質(zhì)粒pEASY-Blunt+H611Q，條件同步驟(2)；通過測序驗證點變體的基因序列；

(10)菌株Alteromonas sp.162普魯蘭酶點突變體異源表達和純化

對重組質(zhì)粒pEASY-Blunt+H611Q與表達載體質(zhì)粒pET-28a(+)進行雙酶切，并制備含目的基因h611Q的重組質(zhì)粒pET28a+H611Q，條件同步驟(2)；重組質(zhì)粒pET28a+Puld5異源表達條件同步驟(5)，純化條件同步驟(6)；

(11)菌株Alteromonas sp.162普魯蘭酶點疊加突變體構建

利用普魯蘭酶截斷突變體引物，Puld5-F5'-CCGCTCGAGCAAACCGTAACCTTGTGCGC-3'，Puld5-R5'-CGCGGATCCCAGTACATGCTCTGAAGTCA-3'，以步驟(10)獲得的含普魯蘭酶基因h611Q的質(zhì)粒為模板，擴增疊加突變體基因puld5/h611Q，擴增條件同步驟(2)，退火溫度重新設為52℃；對puld5/h611Q基因進行回收、連接轉化，獲得重組質(zhì)粒pEASY-Blunt+Puld5/H611Q，條件同步驟(2)；通過測序驗證疊加變體的基因序列；

(12)菌株Alteromonas sp.162普魯蘭酶疊加突變體異源表達和純化

對重組質(zhì)粒pEASY-Blunt+Puld5/H611Q與表達載體質(zhì)粒pET-28a(+)進行雙酶切，并制備含目的基因h611Q的重組質(zhì)粒pET28a+Puld5/H611Q，條件同步驟(2)；

重組質(zhì)粒pET28a+Puld5/H611Q異源表達條件同步驟(5)，純化條件同步驟(6)；

(13)酶活力分析測定

用3,5-二硝基水楊酸法來測定，具體步驟為：取1.0mL的底物溶液在45℃下恒溫10min；隨后加入1.0mL酶液充分混勻后置于45℃的水浴中反應30min；以加熱變性后的酶液作為對照組；反應結束后立即吸取1mL反應液與1.5mL DNS試劑混合，沸水浴加熱5min后迅速用冰水混合物結束反應；最后加入蒸餾水至10mL，上下顛倒混勻于540nm處測定反應混合物的吸光度值OD₅₄₀；

酶活計算公式：酶活

其中，0.67為葡萄糖標準曲線的斜率；ODt為三個實驗組在540nm處吸光值的平均值；OD₀為對照組在540nm處的吸光值；1000為單位換算倍數(shù)；n為稀釋倍數(shù)；180為葡萄糖的分子量；30為反應時間，單位為min；

普魯蘭酶和普魯蘭酶點突變體均不能分泌胞外普魯蘭酶；普魯蘭酶截斷突變體Puld5的胞外組分、胞內(nèi)上清和胞內(nèi)沉淀的酶活性分別為30.5％、62.2％和7.3％；疊加突變體Puld5/H611Q的胞外組分、胞內(nèi)上清和胞內(nèi)沉淀的酶活性分別為35.1％、59.2％和5.7％；普魯蘭酶酶活力為58.05U·mg^-1，普魯蘭酶截斷突變體較普魯蘭酶有所降低，普魯蘭酶點突變體酶活力為87.63U·mg^-1，普魯蘭酶疊加突變體比活力最高達到145.2U·mg^-1，比普魯蘭酶酶活力提高了2.5倍；

(14)酶學性質(zhì)

測定普魯蘭酶和普魯蘭酶突變體的最適pH，測定不同溫度的酶活力，60℃處理不同時間，測定殘存酶活力來確定酶的熱穩(wěn)定性；結果表明，普魯蘭酶和普魯蘭酶突變體最適pH相同，為6.0；

截斷突變體Puld5的最適作用溫度為45℃，比普魯蘭酶的提高了10℃，普魯蘭酶點突變體和疊加突變體的最適反應溫度為50℃，比普魯蘭重組酶提高15℃，截斷突變體Puld5的熱穩(wěn)定性高于普魯蘭酶，半衰期約為25h，為普魯蘭酶的2.5倍左右；點突變體半衰期約為20h，為普魯蘭酶的2.0倍左右，疊加突變體對溫度不敏感，60℃時酶活力為最大酶活力的80％以上；半衰期為普魯蘭酶的5倍；

(15)酶動力學參數(shù)

測定酶動力學參數(shù)：在35℃、pH 6.0的條件下，分別測定在普魯蘭糖濃度的初始反應速度；采用OriginPro 9.0中的線性擬合方法，用雙倒數(shù)作圖法作1/V-1/[S]曲線并求出K_m及V_max值；

普魯蘭酶PulA的Km值為1.78mg·mL^-1，K_cat為1645.5s^-1，其催化效率為924.4s^-1·mg^-1·mL，截斷突變體Puld5的Km值為2.08mg·mL^-1，說明截斷突變體與底物結合的能力降低，截斷突變體的催化效率降低，為普魯蘭酶的86.7％；點突變體H611Q的Km值為1.38mg·mL^-1，K_cat為1668.5s^-1，其催化效率為1209.1s^-1·mg^-1·mL，約為普魯蘭酶的1.3倍；疊加突變體Puld5/H611Q的K_m值為1.71mg·mL^-1，K_cat為1863.6s^-1，其催化效率為1089.8s^-1·mg^-1·mL，約為普魯蘭酶的1.2倍。