[發明專利]一種利用長穗偃麥草特異序列開發的寡聚核苷酸探針

在審

• 申請號: 202110999089.7
• 申請日: 2021-08-28
• 公開（公告）號: CN113718016A
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 戴毅;石俊濤;陳建民
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6841;G16B30/00
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

本發明涉及一種用長穗偃麥草特異序列開發的寡聚核苷酸探針，主要是通過基因組測序的手段，獲取長穗偃麥草中高度重復的序列，設計成寡核酸探針Oligo?pTh1，實驗中可與其他探針組合使用，可以豐富染色體FISH核型圖，用于識別遠緣雜交種質中染色體的結構變異。小麥遠緣雜交材料常常作為中間種質在小麥育種中得以應用，Oligo?pTh1探針可以輔助鑒定出小麥背景中的染色體的結構變異，能夠顯著提外源染色體的鑒定準確性，便于培育出優質的小麥新種質。

技術領域

本發明涉及一種用長穗偃麥草特異序列開發的寡聚核苷酸探針，屬于細胞生物學領域。

技術背景

小麥是三大糧食作物之一，為全世界20％以上的人口提供了所需要的能量和蛋白質。但是，隨著世界人口總數的逐年增長，可耕地面積的縮小，加上全球氣候變化，小麥種植面積逐年下降，而且育種中親本利用單一，缺乏具有突破性的品種。面對小麥育種的現狀，豐富和拓展小麥的遺傳基礎對小麥遺傳育種工作首當其沖，十分重要。實踐證明，小麥近緣野生種攜帶許多優良農藝性狀，將這些優良基因導入普通小麥，可拓寬小麥的遺傳基礎，是小麥遺傳育種研究中常用的途徑之一。

長穗偃麥草是小麥近緣野生種，具有赤霉病高抗特性，是小麥遺傳改良的優良基因資源，在小麥遺傳和育種工作中得到了廣泛的應用。通常我們會利用染色體工程手段，將所需要的染色體片段導入到栽培品種中。因此，如何準確識別長穗偃麥草染色體是獲得優良種質的基礎。目前，鑒定長穗偃麥草染色體身份最常用的方法是FISH分子核型。近年來，隨著原位雜交技術的不斷進步，寡聚核苷酸探針在外源染色體的鑒定中得到廣泛應用。相比于質粒探針，寡聚核苷酸探針具有更短的雜交時間，鑒定效率高，實驗結果重復性好，成本低等優勢。目前寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2、oligo-pAs1等已在小麥中廣泛應用，并且信號較為豐富，可用于FISH核型分析。但這些探針并非來自于長穗偃麥草特異的序列，分析的染色體核型也比較局限。因此，為了豐富長穗偃麥草染色體FISH核型，本發明專利公開一個利用長穗偃麥草特異序列開發的寡聚核苷酸探針。

發明內容

本發明的目的就是針對上述現有技術的缺陷，提供一種用長穗偃麥草特異序列開發的寡聚核苷酸探針。

本發明的目的是這樣實現的：一種利用長穗偃麥草特異序列開發的寡聚核苷酸探針，其特征是，包括以下步驟：

(1)提取長穗偃麥草DNA，得到DNA樣品，將DNA樣品完成整個文庫制備，完成整個文庫制備的步驟包括酶切、加測序接頭、純化、PCR擴增；構建好的文庫通過Illumina測序儀進行測序，將獲取的原始序列進行質控分析，獲得高質量序列；

(2)使用Seqtk程序對獲得的高質量序列進行隨機選擇，所選的序列為測序深度的0.25倍；

(3)利用RepeatExplorer網站中RepeatExplorer Utilities工具下的Preprocessing of FASTQ paired-end reads程序對所選的序列進行整合，具體參數為Read sampling:No，Quality cutoff:10，Percent above cutoff:95，Trim reads:Yes，Start position:1，End position:101，Rename reads:Yes；

(4)利用RepeatExplorer網站中RepeatExplorer2工具下的RepeatExplorer2clustering程序對整合過的數據進行分析；

(5)下載分析后的數據，打開文件中tarean報告，選擇報告中Putativesatellites(high confidence)列出的序列：

AGCCTAGTTCAAATAATTTTACACTAGAGTTGAACTAGCTCTAT，將該序列合成，并在序列的5’端進行TAMRA修飾，獲得Oligo-pTh1探針。