[發明專利]一種基于堿基序列匹配分組的免疫細胞受體轉錄組多樣性檢測多重引物智能選擇方法

在審

• 申請號: 202110996862.4
• 申請日: 2021-08-27
• 公開（公告）號: CN113707220A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 魏平;張翼冠
• 申請（專利權）人: 云測醫學科技（深圳）有限公司
• 主分類號: G16B20/30
• 分類號: G16B20/30;G06F30/20;G06F111/06
• 代理公司: 成都瑞創華盛知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 51270
• 代理人: 鄧瑞;張敏

本發明公開了一種基于堿基序列匹配分組的免疫細胞受體轉錄組多樣性檢測多重引物智能選擇方法，包括將m條FR3序列切分成不同長度的子串、子串去重，進一步根據子串篩選條件(引物長度、退火溫度、CG含量)篩選出符合要求的子串集，通過加權選擇子串，將原始堿基序列進行分組，在分組數盡可能少的情況下使得每個組的公共連續子串盡可能的長，最后篩選出最優的簡并引物集，極大的提高了引物設計效率，有效降低實驗難度及成本。

技術領域

本發明涉及免疫組庫的多重引物自動篩選技術領域，具體涉及一種基于字符串匹配和加權選擇子串并進行分組的多重引物智能選擇方法。

背景技術

免疫組庫(Immune Repertoire，IR)是指在任何指定時間，個體的循環系統內所有功能多樣性B細胞和T細胞的總和。免疫系統的多樣性對機體健康至關重要，其多樣性越豐富，機體的免疫系統就越健康，識別并清除抗原的能力就越強。機體的獲得性免疫能識別無數種抗原分子，并隨之做出反應。其分子基礎為T細胞表面受體和B細胞表面受體(TCR和BCR)特異性識別抗原區段，激活免疫應答。免疫系統中T細胞庫和B細胞庫分別包含了所有特異性不同的T細胞克隆和B細胞克隆。這種識別受體的多樣性在基因重排過程中產生，多樣性體現為受體基因V(D)J片段重組。其中以人類Ig重鏈為例，其排列組合的種類可達40(VH)×25(VD)×6(VJ)＝6000之多。以此類推，Vκ和Vλ的V、J基因片段的組合種類分別達200余種和120余種。理論上IgV區基因片段的組合加上輕重鏈組合后的多樣性約為1.9×10⁶。TCR基因群與BCR基因群的結構相似，其重排過程也相似。TCRβ基因群可變區包括Vβ、Dβ、Jβ三類基因片段，TCRα基因群包括Vα、Jα兩類基因片段，不同基因片段及不同鏈的組合可產生10¹⁶種可能性，因此分析多樣性主要是分析V(D)J片段的序列特征。

目前關于免疫組庫NGS制備技術包括多重PCR與5’RACE(Rapid Amplification ofcDNA Ends)。其中RACE法在逆轉錄、TdT加尾、PCR擴增這三個連接的酶促反應過程中，任何一步的失敗都會導致前功盡棄。即便是上述反應平穩順利，但結果也通常會出現一些非特異性產物或非全長的產物，且成本較高。相比之下，多重PCR建庫簡單易行、成本低等優點便體現出來，成為免疫組庫建庫的優選方法。但是多重PCR存在一個弊端就是不同引物之間會形成引物二聚體，且引物對數越多，二聚體現象越嚴重，這就大大降低了引物的擴增效率。而且，引物對數越多，實驗成本就越高，難度也越大，因此如何用最少的引物擴增最多的文庫便成為了一個挑戰。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，本發明給出了一種基于堿基序列匹配分組的免疫細胞受體轉錄組多樣性檢測多重引物智能選擇方法，通過整合不同V區基因的相對保守區段(FR3)，進行切分、匹配和分組，通過引物長度、退火溫度、CG含量等參數設定，從上百條基因中篩選得到30-50條簡并引物，大大降低了實驗所需的引物對數。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種基于堿基序列匹配分組的免疫細胞受體轉錄組多樣性檢測多重引物智能選擇方法，包括以下步驟：

S1：對于m條FR3堿基序列S_i(i＝1,2,...,m)，采用滑動窗口將每條序列切分成不同長度的連續子串，得到所有序列不同長度的子串集；

S2：將所述所有序列不同長度的子串集去重，得到去重后的子串集；

S3：通過子串篩選條件(引物長度、退火溫度、CG含量)對所述去重后的子串集中的子串進行篩選，去除不滿足條件的子串后，得到子串集P＝{p₁,p₂,...,p_n}，子串集中某個子串表示為p_j(j＝1,2,...,n)，計算其長度為len(p_j)；