[發明專利]一種新型宮頸癌甲基化基因檢測方法

在審

• 申請號: 202110994929.0
• 申請日: 2021-08-27
• 公開（公告）號: CN113549694A
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發明（設計）人: 喻德華;賈樹芹;毛玉
• 申請（專利權）人: 深圳市優圣康生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851
• 代理公司: 深圳市育科知識產權代理有限公司 44509
• 代理人: 賈鵬

1.一種新型宮頸癌甲基化基因檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一，提取宮頸脫落細胞的基因組DNA；

步驟二，對提取的基因組DNA進行重亞硫酸鹽轉化，得到bis-DNA；

步驟三，采用PCR擴增液對bis-DNA進行探針熒光定量PCR擴增，具體為：

針對bis-DNA正鏈和負鏈分別設計正反向引物、檢測探針、以及特異性的封閉探針，使用檢測探針特異性結合甲基化序列目的靶標基因PAX1、FAM19A4、hsa-mir124-2、ATP10A、HAS1、以及內參ACTB(β-actin)基因，使用特異性的封閉探針結合非甲基化的序列，避免其與引物進行結合；

步驟四，根據PAX1、FAM19A4、hsa-mir124-2、ATP10A、HAS1與ACTB基因PCR擴增結果的相對熒光CT值來確定待檢測樣本的甲基化值，并且分別計算PAX1、FAM19A4、hsa-mir124-2、ATP10A、HAS1相對于ACTB基因的甲基化值。

2.根據權利要求1所述的新型宮頸癌甲基化基因檢測方法，其特征在于，所述宮頸細胞PAX1、FAM19A4、hsa-mir124-2、ATP10A、HAS1相對于ACTB基因甲基化值的平均值在12以上的，可以判定為疑似宮頸癌患者。

3.根據權利要求1所述的新型宮頸癌甲基化基因檢測方法，其特征在于，所述宮頸細胞PAX1、FAM19A4、hsa-mir124-2、ATP10A、HAS1相對于ACTB基因甲基化值的平均值在0.9以下的，可以判定為非宮頸癌。

4.根據權利要求1所述的新型宮頸癌甲基化基因檢測方法，其特征在于，所述擴增的反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性15s，62℃5S，58℃退火延伸40s，共50個循環。

5.根據權利要求4所述的新型宮頸癌甲基化基因檢測方法，其特征在于，所述PCR反應液由3部分構成，包括檢測液，陰性對照，和陽性對照；

檢測液包含9種體系，體系1-5為4重體系，體系6-9為5重體系，各體系組成如下：

體系1為4重體系，用來檢測基因PAX1、FAM19A4、hsa-mir-124-2和ACTB；

體系2為4重體系，用來檢測基因PAX1、FAM19A4、HAS1和ACTB；

體系3為4重體系，用來檢測基因PAX1、FAM19A4、ATP10A和ACTB；

體系4為4重體系，用來檢測基因PAX1、hsa-mir-124-2、HAS1和ACTB；

體系5為4重體系，用來檢測基因PAX1、hsa-mir-124-2、ATP10A和ACTB；

體系6為5重體系，用來檢測基因PAX1、FAM19A4、hsa-mir124-2、ATP10A和ACTB；

體系7為5重體系，用來檢測基因PAX1、FAM19A4、hsa-mir124-2、HAS1和ACTB；

體系8為5重體系，用來檢測基因PAX1、FAM19A4、ATP10A、HAS1和ACTB；

體系9為5重體系，用來檢測基因PAX1、hsa-mir124-2、ATP10A、HAS1和ACTB。

6.根據權利要求5所述的新型宮頸癌甲基化基因檢測方法，其特征在于，所述檢測液還包含：0.3μM的脫氧核糖核苷三磷酸，MgCl₂濃度為5mM，DNA聚合酶濃度為0.1U/μL，甘油比例為1％。

7.根據權利要求6所述的新型宮頸癌甲基化基因檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增液的溶劑為無核酸酶水。