[發明專利]一種模擬體內微環境的干細胞和關節軟骨細胞共培養體系的構建方法

在審

• 申請號: 202110993551.2
• 申請日: 2021-08-27
• 公開（公告）號: CN113699100A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 王康;王偉;潘思辰;智曉東;張玉強;徐艷;谷娜;趙迪;常亮
• 申請（專利權）人: 王偉;錦州醫科大學
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/077;C12N5/0775
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 周媛媛;李馨

1.一種模擬體內微環境的干細胞和關節軟骨細胞共培養體系的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)前期準備：預處理Transwell雙層培養室，并將關節軟骨細胞和干細胞進行預培養；

(2)共培養操作：

取干細胞轉移到Transwell雙層培養室上層中，取關節軟骨細胞接種到Transwell雙層培養室下層，加入共培養培養液培養；

或者，取關節軟骨細胞轉移到Transwell雙層培養室上層中，取干細胞接種到Transwell雙層培養室下層，加入共培養培養液培養；

(3)檢測關節軟骨細胞增殖能力和凋亡率，并觀察和檢測干細胞的形態變化及軟骨特異性標志物表達。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述干細胞包括人羊膜上皮細胞、骨髓間充質干細胞、胚胎干細胞、脂肪間充質干細胞、牙髓干細胞、人臍帶間充質干細胞、肌源性干細胞。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，Transwell雙層培養室的預處理方法為：將Transwell雙層培養室用I型膠原蛋白包被18-24h，用PBS清洗后備用。

4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述關節軟骨細胞的預培養方法為：將原代關節軟骨細胞接種于培養容器中，加入關節軟骨細胞培養液培養，待細胞融合率達80％-90％時進行傳代。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述關節軟骨細胞培養液包括10-15v％胎牛血清和1-2v％青鏈霉素的DMEM/F12。

6.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述干細胞的預培養方法為：將原代干細胞接種于培養容器中，加入干細胞培養液培養，待細胞融合率達80％-90％時進行傳代。

7.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于，

所述干細胞為人羊膜上皮細胞時的培養液包括10-20ng/mL表皮生長因子、1-2v％青鏈霉素、10-15v％胎牛血清、1-2v％非必需氨基酸、55-60μmol/Lβ-巰基乙醇、1-2mmol/L丙酮酸鈉的DMEM/F12；

所述干細胞為骨髓間充質干細胞時的培養液包括含10-15v％胎牛血清、1-2v％青鏈霉素的DMEM/F12；

所述干細胞為胚胎干細胞時的培養液包括10-15v％胎牛血清、1-2v％青鏈霉素的DMEM/F12；

所述干細胞為脂肪間充質干細胞時的培養液包括10-15v％胎牛血清、1-2v％青鏈霉素的α-MEM；

所述干細胞為牙髓干細胞時的培養液包括10-15v％胎牛血清、1-2v％青鏈霉素的α-MEM；

所述干細胞為人臍帶間充質干細胞時的培養液包括10-15v％胎牛血清和1-2v％雙抗的H-DMEM；

所述干細胞為肌源性干細胞時的培養液包括10-15v％胎牛血清、1-2v％青鏈霉素的DMEM/F12。

8.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，Transwell雙層培養室的上層細胞接種密度為4×10⁴-16×10⁴個/mL，下層的細胞接種密度為1×10⁴-4×10⁴個/mL，上下層接種細胞密度比例為3:1-4:1；所述的Transwell雙層培養室在上層與下層之間設置的半透膜的孔徑為0.4μm。

9.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述共培養培養液包括10-15v％胎牛血清，1-2v％青霉素-鏈霉素，10-15ng/ml IL-β的高糖DMEM培養基；當干細胞在上層培養室時，共培養的時間為24～48h；當關節軟骨細胞在上層培養室時，共培養的時間為7～21d。

10.權利要求1-9中任一項所述模擬體內微環境的干細胞和關節軟骨細胞共培養體系的構建方法構建的骨性關節炎體外細胞模型。