[發明專利]一種血漿中肝素含量的檢測方法

有效

• 申請號: 202110991684.6
• 申請日: 2021-08-27
• 公開（公告）號: CN113583123B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 馬紅妙;張然
• 申請（專利權）人: 貴州安康醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/577;G01N33/574;G01N33/53
• 代理公司: 重慶強大凱創專利代理事務所(普通合伙) 50217
• 代理人: 劉永來

本發明涉及一種血漿中肝素含量的檢測方法。本發明通過采用雜交瘤方法制備并獲得了針對肝素的單克隆抗體，所述抗體具有較好的特異性以及靈敏度，其可以用于血液樣品中肝素的含量的測定，具有較好的應用價值。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，更具體的涉及一種血漿中肝素含量的檢測方法。

背景技術

肝素首先從肝臟發現而得名，由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替組成的黏多糖硫酸脂，平均分子量為15KDa，呈強酸性。它也存在于肺、血管壁、腸粘膜等組織中，是動物體內一種天然抗凝血物質。天然存在于肥大細胞，現在主要從牛肺或豬小腸黏膜提取。作為一種抗凝劑，是由二種多糖交替連接而成的多聚體，在體內外都有抗凝血作用。臨床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手術、心臟導管檢查、體外循環、血液透析等。隨著藥理學及臨床醫學的進展，肝素的應用不斷擴大。

在目前的研究中，針對肝素的檢測變得尤為重要。比如尿路移行上皮細胞表面被葡萄糖氨基聚糖(glycccmminoglycans，GAGs)所覆蓋，使上皮細胞免受病原體、微晶體、蛋白、致癌因子所粘附，肝素是GAGs的主要成分之一，尿中排泄的肝素主要為GAGs分解脫落產生，因此尿中肝索的排泄量與膀胱腫瘤、感染等疾病可能有一定關系。

測定肝素制劑含量的第一個方法是1924年Howell建立的，其根據是對新鮮全血凝結的抑制作用。這種全血法的修正是將血加硫酸鈉保存，并加牛腦凝血活素，后為英國藥典采用為法定方法，1938年Reiner和Winterstein的方法，用檸檬酸鹽化的羊血漿來測定重鈣化后肝素對凝結時間效應，最終為美國藥典采用為法定方法日。目前各國藥典收載的肝素效價測定方法均是生物檢定法，均應用其抗血凝的藥理作用進行測定，具體方法則有所不同。如英國藥典(1980)、日本藥局方(用硫酸鈉一牛全血法、英國藥典(1980)還規定可用硫酸鈉一牛全血漿、枸櫞酸鈉一羊血漿法(英國藥典1983、1986增補本已將肝素的效價測定改為此法)用平行線測定。美國藥典(USP)從2l版開始則用羊血漿移位均值法測定。中國藥典(1977)用家兔全血法，(1985)、(1990)、(1995)、(2000)用家兔全血法或兔、豬血漿法。

聲色底物法是目前常用的檢測方法。肝素的生色底物測定，近年來發展較快。用生色底物的光度法測定肝素是1976年由Teien等首先提出，1980年Tastad、1984年TenCate等闡述了以S-2222檢測肝素的改革方法。到目前普遍用于肝素測定的生色底物法有兩種。其一種是由Teien法發展起來的，原理為測定抗凝血酶一肝素復合物對X僅因子抑制作用。此法于試驗體系中加入外源性抗凝血酶，在抗凝血酶存在下，肝素具有增強的抗凝活性，此活性直接針對一些凝結因子，其中X儀因子和凝血酶最為突出，因此這兩種酶可用于測定肝素活性。方法之二是由Bartl和Lill于1979年發展起來的，其原理是測定AT-Ⅲ·肝素對凝血酶的抑制作用，即用凝血酶和底物ChromozymTH測定肝素活性。上述兩種用生色底物測定肝素的試劑供應，國外已商業化。生色底物法的最大優點是其在肝素效應測定中的特異性，因而廣泛用于肝素治療的監測和肝素性質的研究。光度法使用，使常規測定的自動化得以實現，這對臨床監測也是很重要的。

但是目前，針對肝素的檢測方法還不夠多，開發不同的檢測思路變得迫在眉睫。單克隆抗體是由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。通常采用雜交瘤技術來制備，雜交瘤(hybridoma)抗體技術是在細胞融合技術的基礎上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。用具備這種特性的單個雜交瘤細胞培養成細胞群，可制備針對一種抗原表位的特異性抗體，即單克隆抗體。單克隆抗體由于純度高、特異性強、可以提高各種血清學方法檢測抗原的敏感性及特異性。因此，開發肝素特異性的單克隆抗體及其檢測方法變得尤為重要。

發明內容

本發明克服現有技術的缺陷，提供了一種采用生物法來檢測血液中肝素含量的方法。

一方面，本發明提供一種特異性針對肝素的單克隆抗體。